吐白水軟化病是柞蠶一種重要的病害,通常發(fā)病于遼寧,吉林,黑龍江等天氣寒冷的地區(qū)。柞蠶患病的機率約為30%,在嚴(yán)重的地域甚至可以超過70%。研究發(fā)現(xiàn),柞蠶Iflavirus病毒(ApIV)是柞蠶吐白水軟化病的病原之一,是小RNA病毒科一株單正鏈RNA病毒。小RNA病毒科病毒的3C蛋白酶具有高度保守的活性位點。3C蛋白酶在病毒復(fù)制中有前體蛋白切割的功能,且在宿主細胞內(nèi)沒有同源位點,常被選為研制抗小RNA病毒抑制劑的靶標(biāo)。對3C蛋白酶已經(jīng)進行了長期的大量的研究,但是還沒有針對ApIV 3C蛋白酶抑制劑的研究。在本論文中,通過同源建模以及分子動力學(xué)的方法構(gòu)建了ApIV 3C蛋白酶的三維結(jié)構(gòu),通過基于分子對接的虛擬篩選,從含3500多個分子的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中篩選出15個候選化合物,通過體內(nèi)外的病毒抑制實驗,獲得異黃酮類化合物Orobol,發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗ApIV病毒活性。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,隨著Orobol濃度的升高,其抑制病毒復(fù)制率越高,當(dāng)Orobol的濃度達到10μg/ml時,抑制病毒復(fù)制率達到80.5%,并且在此濃度下,細胞毒性造成的細胞活性的降低僅為3.42%,細胞毒性低。體內(nèi)實驗通過觀...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 柞蠶吐白水軟化病研究進展
        1.1.1 病癥
        1.1.2 病原
        1.1.3 防治藥物研究
    1.2 ApIV病毒
        1.2.1 小RNA病毒概述
        1.2.2 ApIV結(jié)構(gòu)及基因組學(xué)
        1.2.3 ApIV復(fù)制周期
    1.3 3C蛋白酶
        1.3.1 3C蛋白酶的靶標(biāo)功能
        1.3.2 3C蛋白酶的結(jié)構(gòu)
    1.4 3C蛋白酶抑制劑研究進展
        1.4.1 肽類抑制劑
        1.4.2 非肽類抑制劑
        1.4.3 微生物提取物
    1.5 同源建�；A(chǔ)理論
    1.6 基于分子對接虛擬篩選
        1.6.1 分子對接基礎(chǔ)理論
        1.6.2 分子對接分類
    1.7 分子動力學(xué)
        1.7.1 分子動力學(xué)理論基礎(chǔ)
        1.7.2 分子動力學(xué)的過程
    1.8 先導(dǎo)化合物優(yōu)化
    1.9 研究的目的與意義
    1.10 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
2 基于分子對接的虛擬篩選
    2.1 引言
    2.2 計算分析軟件
    2.3 ApIV 3C蛋白酶的同源建模和模型評估
        2.3.1 同源建模
        2.3.2 模型的評估
        2.3.3 分子動力學(xué)模擬
    2.4 基于分子對接的虛擬篩選
        2.4.1 活性位點的選擇
        2.4.2 AutoDock 4.2
        2.4.3 LibDock
        2.4.4 CDOCKER
        2.4.5 化合物的類藥5規(guī)則
    2.5 結(jié)果分析
        2.5.1 ApIV 3C蛋白酶的同源建模和模型驗證
        2.5.2 基于分子對接的虛擬篩選
    2.6 本章小結(jié)
3 化合物的合成與結(jié)構(gòu)鑒定
    3.1 引言
    3.2 實驗材料和設(shè)備
        3.2.1 菌株
        3.2.2 實驗設(shè)備
        3.2.3 試劑配置
    3.3 菌株搖瓶發(fā)酵研究
        3.3.1 阿維鏈霉菌的活化
        3.3.2 最佳碳氮源篩選實驗
        3.3.3 裝液量條件優(yōu)化
    3.4 Genistei與阿維鏈霉菌NRRL8165的生物轉(zhuǎn)化
    3.5 代謝產(chǎn)物的分離與結(jié)構(gòu)分析
    3.6 結(jié)果分析
        3.6.1 最佳碳氮源篩選結(jié)果
        3.6.2 裝液量條件優(yōu)化結(jié)果
        3.6.3 Orobol的合成與結(jié)構(gòu)鑒定
    3.7 本章小結(jié)
4 化合物的生物活性驗證
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和設(shè)備
        4.2.1 化合物、細胞株、病毒、實驗動物
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 實驗設(shè)備
        4.2.4 試劑配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 細胞準(zhǔn)備
        4.3.2 ApIV病毒的繁殖與提取
        4.3.3 CCK-8 法檢測ApIV病毒的TCID50值
        4.3.4 ApIV病毒接種量的優(yōu)化
        4.3.5 q-PCR法初篩活性化合物
        4.3.6 活性化合物的q-PCR實驗驗證
        4.3.7 細胞毒性實驗
        4.3.8 體內(nèi)實驗
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 ApIV病毒的TCID50的測定
        4.4.2 ApIV病毒接種量的確定
        4.4.3 q-PCR法初篩活性化合物的結(jié)果
        4.4.4 活性化合物Orobol的q-PCR實驗驗證
        4.4.5 細胞毒性實驗
        4.4.6 體內(nèi)實驗
    4.5 本章小結(jié)
5 先導(dǎo)化合物結(jié)合模式的研究及修飾
    5.1 引言
    5.2 蛋白-配體復(fù)合物的MD模擬
    5.3 基于反應(yīng)的原位生長方法優(yōu)化先導(dǎo)化合物
    5.4 結(jié)果分析
        5.4.1 MD模擬結(jié)果分析
        5.4.2 分子對接結(jié)果分析
        5.4.3 基于反應(yīng)的原位生長方法優(yōu)化先導(dǎo)化合物結(jié)果分析
    5.5 本章小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點與展望
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號：3935982