油菜(Brassica napus)是我國主要的油料作物之一,由死體營養(yǎng)型病原真菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)所致的油菜菌核病是對我國油菜生產(chǎn)危害最大的病害。但是,油菜抗菌核病資源缺乏,對油菜與核盤菌互作的機(jī)制研究還不夠深入,抗核盤菌相關(guān)的調(diào)控因子亟待鑒定。因此,利用油菜基因組得到測定和解析的契機(jī),本研究組合采用sRNA組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及磷酸化蛋白質(zhì)組等功能組學(xué)技術(shù),對油菜與核盤菌互作機(jī)理進(jìn)行組學(xué)解析,獲得了以下主要結(jié)果:(1)開展了油菜與核盤菌互作的miRNA組學(xué)分析,揭示了 miRNA和AGO介導(dǎo)的RNA沉默對油菜與核盤菌互作的重要調(diào)控作用。通過高通量測序,鑒定得到油菜227個保守miRNA和53個新miRNA,并通過降解組測序鑒定了其中237個miRNA的靶基因。采用miRNA芯片分析鑒定獲得68個響應(yīng)核盤菌侵染的miRNAs,其中一組靶標(biāo)植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因,包括NBS-LRR類抗病基因以及一氧化氮和活性氧相關(guān)基因。還有三個miRNA分別靶標(biāo)RNA沉默核心基因AGO1和AGO2。瞬時表達(dá)RNA沉默抑制子減弱了植株對核盤菌的抗性。擬南芥ago1...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 研究背景
    1.1 核盤菌與油菜菌核病
        1.1.1 核盤菌的生物學(xué)特性及危害
        1.1.2 核盤菌的重要致病因子及致病機(jī)理研究進(jìn)展
        1.1.3 油菜抗菌核病研究進(jìn)展
    1.2 RNA沉默及其在植物-病原物互作中的調(diào)控功能
        1.2.1 RNA沉默的機(jī)理
        1.2.2 RNA沉默通路關(guān)鍵蛋白及其在植物-病原物互作中的調(diào)控功能
        1.2.3 植物miRNA及其抗病調(diào)控功能研究進(jìn)展
    1.3 組學(xué)技術(shù)在植物抗病研究中的應(yīng)用
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)
        1.3.2 sRNA組研究技術(shù)
        1.3.3 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)
    1.4 本研究的目的和內(nèi)容
第二章 油菜與核盤菌互作相關(guān)microRNAs的組學(xué)鑒定及功能分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 sRNA文庫的構(gòu)建和Illumina深度測序
        2.1.3 測序數(shù)據(jù)分析
        2.1.4 降解組文庫構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析
        2.1.5 miRNA芯片表達(dá)譜分析
        2.1.6 實時熒光定量PCR分析
        2.1.7 MicroRNA靶基因5'RACE驗證分析
        2.1.8 沉默抑制子功能分析
        2.1.9 MicroRNA瞬時超表達(dá)
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 油菜sRNA高通量測序基本數(shù)據(jù)的獲得
        2.2.2 油菜中已知以及保守miRNA的鑒定
        2.2.3 油菜中新發(fā)現(xiàn)的miRNA的鑒定獲得
        2.2.4 利用降解組測序鑒定miRNA靶基因
        2.2.5 油菜中抗核盤菌相關(guān)的miRNA的鑒定
        2.2.6 抗核盤菌相關(guān)油菜miRNA及其靶基因的驗證
        2.2.7 沉默抑制子的功能研究結(jié)果證明了RNA沉默在抗核盤菌中的作用
        2.2.8 瞬時超表達(dá)靶標(biāo)AGO1和AGO2的miRNA降低了AGO1和AGO2的表達(dá)水平,同時增加了油菜對核盤菌的敏感性
        2.2.9 擬南芥ago2-1突變體表現(xiàn)比野生型更高的核盤菌敏感性
    2.3 討論
        2.3.1 油菜miRNA及其靶標(biāo)的鑒定
        2.3.2 參與油菜與核盤菌互作的miRNA
第三章 油菜RNAi通路關(guān)鍵基因家族的組學(xué)鑒定及其抗病調(diào)控功能分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3.1.3 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析和命名
        3.1.4 基因結(jié)構(gòu)分析以及啟動子區(qū)順式作用元件預(yù)測
        3.1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.1.6 實時熒光定量PCR分析
        3.1.7 油菜CAMTA3蛋白CG1結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)及純化
        3.1.8 凝膠阻滯分析(EMSA)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因的鑒定及分析
        3.2.2 DCLs、AGOs和RDRs基因的進(jìn)化樹分析
        3.2.3 DCLs、AGOs和RDRs蛋白的理化特性和結(jié)構(gòu)域組成分析
        3.2.4 DCLs、AGOs和RDRs家族的基因結(jié)構(gòu)分析以及順式作用元件預(yù)測
        3.2.5 組成性和核盤菌接種條件下BnDCLs、BnAGOs、BnRDRs和BnCAMTA3s的表達(dá)分析
        3.2.6 凝膠阻滯分析(EMSA)證明BnCAMTA3與部分BnDCL、BnAGO以及BnRDR家族基因互作
        3.2.7 擬南芥dcl、ago和rdr突變體植株普遍表現(xiàn)出對核盤菌敏感性的改變
    3.3 討論
        3.3.1 油菜中的基因沉默機(jī)制
        3.3.2 RNA沉默在植物抗真菌病害中的作用
        3.3.3 CAMTA3對RNA沉默的調(diào)控
第四章 AGO2調(diào)控核盤菌抗性的組學(xué)分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 測序樣品準(zhǔn)備
        4.1.3 轉(zhuǎn)錄組測序
        4.1.4 sRNA組測序
        4.1.5 實時熒光定量PCR分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析
        4.2.2 sRNA組測序分析
        4.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序和sRNA測序的聯(lián)合分析
        4.2.4 熒光定量PCR驗證差異表達(dá)mRNA和miRNA
        4.2.5 擬南芥gstu2、gstu5以及rbohf突變體植株對核盤菌的抗病性分析
    4.3 討論
第五章 油菜與核盤菌互作的定量蛋白組學(xué)分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 樣品準(zhǔn)備
        5.1.3 油菜葉片的DAB染色觀察
        5.1.4 油菜葉片蛋白質(zhì)的提取以及濃度測定
        5.1.5 蛋白質(zhì)的酶解
        5.1.6 肽段的TMT標(biāo)記
        5.1.7 標(biāo)記后肽段的脫鹽
        5.1.8 質(zhì)譜分析
        5.1.9 實時熒光定量PCR分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 油菜接種核盤菌后的癥狀觀察以及ROS產(chǎn)生情況檢測
        5.2.2 響應(yīng)不同核盤菌菌株的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        5.2.3 油菜響應(yīng)不致病的核盤菌突變體菌株Ep-1PB的蛋白質(zhì)組
        5.2.4 油菜響應(yīng)核盤菌野生型菌株1980的蛋白質(zhì)組
        5.2.5 油菜響應(yīng)野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB的蛋白質(zhì)組的比較分析
        5.2.6 對野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB差異響應(yīng)的油菜蛋白的互作關(guān)系
        5.2.7 采用qRT-PCR分析驗證了通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析獲得的差異表達(dá)蛋白
    5.3 討論
第六章 油菜響應(yīng)核盤菌的磷酸化蛋白質(zhì)組分析
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 樣品準(zhǔn)備
        6.1.3 油菜葉片蛋白質(zhì)的提取以及濃度測定
        6.1.4 蛋白質(zhì)的酶解
        6.1.5 磷酸化肽富集
        6.1.6 肽段的脫鹽
        6.1.7 質(zhì)譜分析
        6.1.8 磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 磷酸化蛋白、肽段、位點的整體情況
        6.2.2 差異表達(dá)磷酸化蛋白的鑒定
        6.2.3 磷酸化蛋白與全蛋白比較
    6.3 討論
第七章 全文小結(jié)與研究展望
    7.1 全文小結(jié)
    7.2 研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄 附表以及論文相關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配方



本文編號：3851317