辣椒溶桿菌(Lysobacter capsici)X2-3是本實(shí)驗(yàn)室從小麥根際土壤中分離得到的一株溶桿菌菌株,對(duì)多種植物病原真菌和卵菌具有明顯的拮抗活性。該菌株菌落表面光滑,GC%含量高,具有很強(qiáng)的滑動(dòng)性。本研究以L.capsici X2-3為出發(fā)菌株,構(gòu)建了X2-3轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變體庫(kù),從突變體庫(kù)中篩選生物膜表型變化的突變株,并對(duì)突變體MT4的相關(guān)基因功能進(jìn)行了分析。取得的主要研究結(jié)果如下:1.隨機(jī)插入突變體庫(kù)構(gòu)建利用Tn5隨機(jī)插入法對(duì)X2-3進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變,獲得了4800余個(gè)插入突變體。以生物膜表型特征為依據(jù),篩選得到了7株生物膜表型變化的突變株,分別命名為MT1-MT7。通過質(zhì)粒拯救法,確定了Tn5在不同突變體中插入的目的基因位點(diǎn),其中3個(gè)突變株插入位點(diǎn)在同一個(gè)基因LC0409,其余4個(gè)突變體插入位點(diǎn)分別在基因LC3417,LC3753,LC4356和LC0306。2.突變體MT4插入基因的功能預(yù)測(cè)對(duì)突變株MT4插入基因在GenBank中比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn),該基因編碼GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其氨基酸序列與辣椒溶桿菌L.capsici(ID:ALN83455)氨基酸序列相似性達(dá)到10...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 溶桿菌的研究進(jìn)展
        1.1.1 溶桿菌屬的分類地位
        1.1.2 溶桿菌屬的生物學(xué)特性
        1.1.3 辣椒溶桿菌(L.capsici)的研究進(jìn)展
    1.2 轉(zhuǎn)座子插入突變
        1.2.1 轉(zhuǎn)座子
        1.2.2 側(cè)翼序列的獲得
            1.2.2.1 Plasmid rescue(質(zhì)粒拯救)技術(shù)
            1.2.2.2 IPCR(Inverse PCR)技術(shù)
            1.2.2.3 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interiaced PCR)技術(shù)
            1.2.2.4 PCR-Walking(PCR步移)技術(shù)
        1.2.3 轉(zhuǎn)座子插入突變?cè)诩?xì)菌功能研究中的應(yīng)用
    1.3 細(xì)菌生物膜
        1.3.1 生物膜形成過程
        1.3.2 生物膜結(jié)構(gòu)和組成
        1.3.3 生物膜的作用
    1.4 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
        1.4.1 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的特性
        1.4.2 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能
    1.5 本研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 酶與試劑
        2.1.5 引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.1.1 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.1.2 感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化
        2.2.2 突變體的篩選及質(zhì)粒拯救法鑒定側(cè)翼序列
            2.2.2.1 突變體的篩選
            2.2.2.2 突變體生物膜表面形態(tài)變化的驗(yàn)證
            2.2.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取
            2.2.2.4 PCR驗(yàn)證
            2.2.2.5 基因組DNA的酶切
            2.2.2.6 酶切產(chǎn)物的純化
            2.2.2.7 純化酶切產(chǎn)物的連接
            2.2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.2.9 質(zhì)粒DNA的小量提取
            2.2.2.10 轉(zhuǎn)化
        2.2.3 突變體突變基因功能互補(bǔ)
            2.2.3.1 突變基因的獲得
            2.2.3.2 PCR產(chǎn)物的回收
            2.2.3.3 重組載體Blunt-4356 的構(gòu)建及驗(yàn)證
            2.2.3.4 重組載體Blunt-4356 的酶切和回收
            2.2.3.5 表達(dá)載體pBBR1MCS-5 的酶切和回收
            2.2.3.6 重組表達(dá)載體PBBR1-4356 的構(gòu)建及驗(yàn)證
            2.2.3.7 重組表達(dá)載體PBBR1-4356 與突變菌株的電轉(zhuǎn)化
            2.2.3.8 LC4356 基因互補(bǔ)突變體的篩選
        2.2.4 熒光定量PCR
            2.2.4.1 RNA的提取
            2.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成c DNA
            2.2.4.3 熒光定量PCR擴(kuò)增
            2.2.4.4 數(shù)據(jù)分析
        2.2.5 野生株、突變株和回復(fù)株的表型及活性分析
            2.2.5.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
            2.2.5.2 生物膜的測(cè)定
            2.2.5.3 抑菌活性的測(cè)定
            2.2.5.4 胞外多糖的測(cè)定
            2.2.5.5 滑動(dòng)性的測(cè)定
            2.2.5.6 抗逆性的測(cè)定
3 結(jié)果與分析
    3.1 突變體的篩選和驗(yàn)證
        3.1.1 突變體的篩選
        3.1.2 突變體的驗(yàn)證
        3.1.3 突變體側(cè)翼序列的確認(rèn)
    3.2 突變體MT4 的插入基因及生物學(xué)特性
        3.2.1 LC4356 基因的分析
        3.2.2 突變體和野生株菌落形態(tài)的變化
        3.2.3 突變體和野生株生物膜產(chǎn)量的變化
        3.2.4 突變體和野生株抑菌活性的變化
    3.3 突變體MT4 突變基因互補(bǔ)
        3.3.1 LC4356 基因的PCR擴(kuò)增
        3.3.2 重組載體的構(gòu)建
        3.3.3 重組表達(dá)載體PBBR1-4356 的酶切
        3.3.4 回復(fù)菌株MCS-4356 的篩選及驗(yàn)證
    3.4 GntR對(duì)上游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        3.4.1 菌株RNA提取
        3.4.2 反轉(zhuǎn)錄成c DNA
        3.4.3 熒光定量PCR
    3.5 野生株和突變株生物膜及生物學(xué)特性變化
        3.5.1 GntR的突變對(duì)生長(zhǎng)的影響
        3.5.2 GntR的突變對(duì)生物膜產(chǎn)量的影響
        3.5.3 GntR的突變對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響
        3.5.4 GntR的突變對(duì)運(yùn)動(dòng)性的影響
        3.5.5 野生株與突變株抗逆性的比較
4 討論
    4.1 EZ-Tn5 隨機(jī)插入突變體的篩選和側(cè)翼序列分析
    4.2 LC4356 基因回復(fù)菌株的構(gòu)建
    4.3 突變體生物學(xué)相關(guān)特性及抗逆性的研究
    4.4 GntR家族基因LC4356對(duì)其上游基因的調(diào)節(jié)作用
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間論文發(fā)表情況



本文編號(hào)：3829301