柑橘潰瘍病由黃單胞桿菌屬地毯草黃單胞柑橘致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的一種細菌性病害。柑橘潰瘍病菌能侵染植株的葉片、枝條、皮刺和果實,引起葉片及果實潰瘍斑,降低果實的品質和營養(yǎng)價值,嚴重時會導致落葉落果,樹勢減弱,已經被列為世界范圍內的檢疫性病害。目前,普遍采用銅制劑及農用抗生素進行防治。然而,傳統(tǒng)化學農藥施用易引起了環(huán)境污染、農藥殘留及病原菌耐藥性等一系列問題,使得近年來發(fā)展安全、無毒、無污染的新型生物農藥倍受重視。本文旨在篩選拮抗柑橘潰瘍病菌的土壤細菌,并針對鑒定到的一株F9拮抗菌株,進行其抑菌物質的初步探索。1.本文從湖南省永州市江永縣患病的柑橘果園根際土壤中取樣,分離根際微生物。采用抑菌圈法篩選拮抗柑橘潰瘍病菌的細菌,總共篩選到22株具有抑菌活性的細菌。采用細菌16SrDNA基因序列比對的方法,初步鑒定其中2株屬于假單胞屬,1株屬于節(jié)桿菌屬,19株屬于芽孢桿菌屬。對其中抑菌效果明顯的菌株上清液進行抑菌活性實驗,其中編號F4,F6,F9的三株細菌上清液具有抑菌活性。2.文中選取了抑菌活性最強的F9菌株進行了深入研究。采用掃...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮寫詞和英漢對照表
第一章 前言
    1.1 柑橘潰瘍病及柑橘潰瘍病菌簡介
    1.2 柑橘潰瘍病菌的生理形態(tài)特征
    1.3 柑橘潰瘍病菌的侵染循環(huán)
    1.4 柑橘潰瘍病的防治
        1.4.1 物理防治
        1.4.2 化學防治
        1.4.3 生物防治
    1.5 芽孢桿類拮抗菌的研究現(xiàn)狀
        1.5.1 芽孢桿菌的生防機制
        1.5.2 生防芽孢的種類
    1.6 解淀粉芽孢桿菌抑菌物質
        1.6.1 抗菌蛋白
        1.6.2 脂肽類物質
        1.6.3 聚酮類物質
    1.7 研究目的和意義
    1.8 技術路線圖
第二章 柑橘潰瘍病菌拮抗菌的篩選鑒定
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 供試材料
            2.2.1.1 菌株
            2.2.1.2 主要儀器
        2.2.2 柑橘潰瘍病拮抗細菌的篩選
            2.2.2.1 柑橘根際土壤樣品采集
            2.2.2.2 柑橘潰瘍病菌拮抗菌的分離篩選
            2.2.2.3 拮抗細菌的復篩
            2.2.2.4 拮抗菌發(fā)酵上清液活性測試
        2.2.3 拮抗菌的種類鑒定
            2.2.3.1 拮抗細菌 16SrDNA序列PCR測定與分析
            2.2.3.2 芽孢桿菌 16-23S之間ITS序列擴增
            2.2.3.3 拮抗芽孢桿菌種間的系統(tǒng)發(fā)育樹構建
    2.3 結果與分析
        2.3.1 拮抗菌篩選
            2.3.1.1 拮抗菌初篩
            2.3.1.2 拮抗菌的復篩
        2.3.2 拮抗菌株鑒定
        2.3.3 ITS基因序列擴增鑒定
        2.3.4 拮抗菌發(fā)酵上清液活性測試
    2.4 討論
第三章 拮抗菌株F9的鑒定及其抑菌物質的探究
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 供試材料
            3.2.1.1 供試菌株
            3.2.1.2 培養(yǎng)基及配方
            3.2.1.3 主要儀器
        3.2.2 拮抗菌株F9的鑒定
            3.2.2.1 拮抗菌株F9的菌落形態(tài)
            3.2.2.2 拮抗菌株F9生理生化特性檢測
            3.2.2.3 拮抗菌株F9的 16SrDNA PCR鑒定
            3.2.2.4 拮抗菌株F9的ITS PCR鑒定
            2.2.3.5 解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 β-甘露聚糖酶基因序列特異性擴增
        3.2.3 拮抗芽孢桿菌F9抑菌效果測試
            3.2.3.1 F9菌體抑菌效果測試
            3.2.3.2 F9發(fā)酵上清液的抑菌效果測試
            3.2.3.3 F9產抑菌物質培養(yǎng)基的選擇
        3.2.4 F9抑菌物質的探究
            3.2.4.1 抑菌蛋白的提取
            3.2.4.2 抑菌蛋白穩(wěn)定性的研究
            3.2.4.3 脂肽的提取
            3.2.4.4 脂肽穩(wěn)定性的研究
        3.2.5 粗提脂肽對Xac jx-6 生長曲線的影響
            3.2.5.1 脂肽粗提的濃度檢測
            3.2.5.2 Xac jx-6 生長曲線的測量
        3.2.6 拮抗菌F9菌體盆栽接種防治試驗
            3.2.6.1 微生物的培養(yǎng)
            3.2.6.2 柑橘盆栽接種試驗
        3.2.7 粗提脂肽活體接種防治效果
            3.2.7.1 微生物的培養(yǎng)
            3.2.7.2 柑橘盆栽接種試驗
        3.2.8 粗提脂肽的抑菌譜試驗
        3.2.9 粗提脂肽的分離純化
        3.2.10 抑菌物質LC-MS分析
        3.2.11 初純抑菌物質的最小抑菌濃度(MIC)測定
    3.3 結果和分析
        3.3.1 F9菌落形態(tài)
        3.3.2 F9生理生化鑒定
        3.3.3 F9 β-甘露聚糖酶基因序列特異性擴增
        3.3.4 F9系統(tǒng)發(fā)育樹
        3.3.5 F9透射電鏡圖
        3.3.6 拮抗菌株F9抑菌測試
            3.3.6.1 F9菌體的抑菌效果
            3.3.6.2 F9發(fā)酵上清液抑菌效果
        3.3.7 培養(yǎng)基的篩選
        3.3.8 F9菌株上清液抑菌物質的提取和驗證
            3.3.8.1 抑菌蛋白的提取
            3.3.8.2 抑菌蛋白穩(wěn)定性
        3.3.9 F9上清液脂肽的提取和驗證
            3.3.9.1 粗提脂肽的抑菌活性
            3.3.9.2 粗提脂肽穩(wěn)定性試驗
        3.3.10 粗提脂肽對Xac jx-6 生長曲線的影響
            3.3.10.1 粗提脂肽的濃度測量
            3.3.10.2 粗提脂肽對Xac jx-6 生長曲線的影響
        3.3.11 F9菌體盆栽防治試驗
        3.3.12 粗提脂肽盆栽防治試驗
        3.3.13 粗提脂肽的抑菌譜
        3.3.14 初步純化后抑菌物質的最小抑菌濃度(MIC)的測定
        3.3.15 粗提脂肽的分離純化
            3.3.15.1 抑菌活性組分的初步分離
            3.3.15.2 初步純化后活性物質的HPLC分析
            3.3.15.3 Sephadex G-25 凝膠柱過濾純化
            3.3.15.4 抑菌物質LC-MS分析
    3.4 討論
        3.4.1 抑菌物質的提取
        3.4.2 抑菌物質的盆栽接種防治試驗
        3.4.3 抑菌物質的分離純化
        3.4.4 抑菌物質的鑒定
致謝
參考文獻
附錄



本文編號：3745251