南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是由介體白背飛虱（Sogatella furcifera,WBPH）進行傳播的一種雙鏈RNA病毒,侵染水稻后植株嚴重矮縮,嚴重影響作物產(chǎn)量。目前,關于外殼蛋白P10在病毒侵染寄主水稻中的作用機制并不清楚。因此本研究通過酵母雙雜系統(tǒng)篩選與P10互作的寄主因子,進一步研究這種互作關系在SRBSDV侵染過程中發(fā)揮怎樣的作用。本研究利用酵母雙雜交技術,構建誘餌質(zhì)粒p BT3-SUC-P10,利用酵母DUAL膜體系（DUAL membrane system）以水稻c DNA文庫為模板篩選與P10互作的寄主因子。進一步對篩選到的陽性克隆進行分析后,挑選3個與葉綠體相關的蛋白,并對其進行回轉(zhuǎn)驗證,證明其在酵母中發(fā)生互作。利用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,Co-IP）技術在煙草瞬時表達系統(tǒng)中證實了Os PS1-L、Os PT3、Os LPA1與P10發(fā)生相互作用。在煙草表皮細胞中的亞細胞定位結果表明P10蛋白與Os PS1-L定位在葉綠體和細胞質(zhì)上,與Os P... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學福建省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SRBSDV的病毒粒子[11]

中加入 100 μL 含有氨芐霉素抗性的 LB 液體培養(yǎng)基；（7）37 ℃，220 r min-1 震蕩培養(yǎng) 3 h，進行菌落 PCR，挑選有條帶的樣品吸取 50 μL 送公司測序。2.3 結果與分析2.3.1 RT-PCR 擴增 P10 全長以 SRBSDV 侵染的水稻 c DNA 為模板，利用特異引物（表 2-1）對目的基因進行 RT-PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約在 1700 bp 處出現(xiàn)與目的基因大小一致的條帶，電泳圖如 2-1 所示：

與南方水稻黑條矮縮病毒P10蛋白互作的寄主因子篩選及其對葉綠體結構與功能影響的研究172.3.2誘餌表達載體的構建膜系統(tǒng)酵母表達載體pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N在Sfi1酶切位點進行酶切后，與P10PCR產(chǎn)物一起切膠回收，二者連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，熱激孵育后涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌落PCR結果如圖2-2，送公司測序。測序結果與P10序列比對成功后，提取對應菌液質(zhì)粒并酶切鑒定，結果如圖2-3所示，構建的誘餌質(zhì)粒經(jīng)酶切后在1700bp處有目標條帶，表明P10成功連建到了膜系統(tǒng)酵母表達載體pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N上。圖2-2PCR檢測誘餌載體陽性克隆Fig.2-2PCRdetectionofbaitvectorpositiveclones圖2-3誘餌質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2-3Identificationofbaitplasmiddigestion2.3.3酵母膜系統(tǒng)功能驗證在檢測膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的功能時，如果誘餌蛋白在酵母細胞內(nèi)具有表達功能，便會依據(jù)誘餌蛋白的表達水平在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上有10%-100%的生長率。而自激活檢測的SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上，應觀察不到顯著的生長。在陽性對照的表2-2反應1中，pTSU2-APP與pNubG-Fe65具有強相互作用，而作為陰性對照的pTSU2-APP與pPR3N在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上的生長顯著少于陽性對照。檢測誘餌基因功能時發(fā)現(xiàn)載體pBT3-N-P10在SD-THL篩選平板上生長較好但在SD-Ade/His/Leu/Trp篩選平板上生長較少，而pBT3-


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