受體細胞中外源基因的表達是植物基因工程中的關鍵問題,啟動子是基因表達的重要調(diào)控序列之一,是基因表達調(diào)控的關鍵點。本研究中,通過生物信息學分析得到了一個來自橡膠樹白粉菌（Oidium heveae B.A.Steinm.）的疑似內(nèi)源啟動子,命名為WY172。通過瞬時表達、GUS染色實驗、GUS活性分析等對該啟動子功能進行驗證,引入外源功能基因HpaXm,通過穩(wěn)定表達、微過敏、煙草花葉病毒（TMV）接種、實時熒光定量PCR、GUS活性檢測等實驗對WY172驅(qū)動HpaXm基因的表達效果進行探究,并通過誘導元件分析、誘導實驗和GUS染色等對WY172的啟動子類型進行了分析;采取對WY172啟動子上游2K序列進行漸變?nèi)笔蛔�、誘導元件分析和啟動子活性分析等方法進行分析,探究WY172是否具有多元化誘導的可能性。主要結(jié)果如下:1.獲得了重組表達載體pBI121-GFP（轉(zhuǎn)空載體）、pBI121-ACT1（陽性對照）、pBI121-WY172,證明WY172具有啟動子功能,可以驅(qū)動報告基因GUS的表達,并且在單子葉植物水稻和雙子葉植物煙草中均能發(fā)揮啟動子作用。2.構(gòu)建了pBI121-WY172-Hp... 

【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同片段插入pBI121載體的結(jié)構(gòu)示意

海南大學碩士學位論文27倍（圖2，c）。結(jié)果證明WY172是一個可以驅(qū)動單子葉植物水稻和雙子葉植物煙草中外源基因表達的啟動子。同時為了確定不同啟動子片段的GUS酶活性，繪制了BSA標準曲線和4-MU標準曲線，R2值分別為0.9997（圖3，a）和0.9994（圖3，b），滿足測定要求。SPSS軟件對酶活性的統(tǒng)計分析表明，WY172驅(qū)動GUS表達的活性在煙草和水稻中分別是35S和ACT1的2倍多（圖3，c；圖3，d），這證明無論是在單子葉植物水稻還是雙子葉植物煙草中，WY172均具有啟動子活性。圖2煙草和水稻的不同菌株瞬時表達的GUS表達差異Fig.2DifferencesinGUSExpressionofTransientExpressionofDifferentAgrobacteriumStrainsinTobaccoandRice顯示了農(nóng)桿菌侵染五天后，陰性對照品系（GFP和WT）和三個轉(zhuǎn)基因品系（CaMV35S，ACT1，WY172）GUS表達的結(jié)果，其中ACT1是單子葉植物水稻中的陽性對照，而CaMV35S是雙子葉植物煙草中的陽性對照。a水稻和煙草瞬時表達后的GUS染色結(jié)果，b是煙草中GUS基因相對表達量，c是水稻中GUS基因的相對表達量。條形圖上方的不同小寫字母表示不同數(shù)據(jù)的多次比較之間存在顯著差異（P<0.05）。實驗設置三次重復，獲得一致結(jié)果。FivedaysafterAgrobacteriuminfection,thenegativecontrollines(GFPandWT)andthreetransgeniclines(CaMV35S,ACT1,WY172)GUSexpressionresults,whereACT1isapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Sisapositivecontrolofdicotyledonoustobacco.AndaistheGUSstainingaftertransientexpressionofriceandtobacco,bistherelativeexpressionlevelofGUSgeneintobacco,andcistherelativeexpressionlevelofGUSgeneinrice.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantd

橡膠樹白粉菌啟動子WY172的克壟功能鑒定及其對HpaXm基因的調(diào)控分析28圖3煙草葉盤和水稻愈傷組織中瞬時表達的不同啟動子的GUS活性差異Fig.3GUSDifferencesinGUSactivityofdifferentpromoterstransientlyexpressedintobaccoleavesandricecallus農(nóng)桿菌侵染五天后，測定不同菌株侵染后煙草和水稻的GUS活性，其中ACT1是單子葉植物水稻中的陽性對照，而CaMV35S是雙子葉植物煙草中的陽性對照。aBSA蛋白標準曲線，b4-MU標準曲線，c煙草中的GUS活性，d水稻中的GUS活性。條形圖上方的不同小寫字母表示不同數(shù)據(jù)的多次比較之間存在顯著差異（P<0.05）。實驗設置三次重復，獲得一致結(jié)果。FivedaysaftertheinfectionwithAgrobacterium,theGUSactivityoftobaccoandriceafterdifferentstrainsofinfectionwasdeterminedACT1wasapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Swasapositivecontrolindicotyledonoustobacco.AndaisBSAproteinstandardcurve,bis4-MUstandardcurve,cisGUSactivityintobacco,disGUSactivityinrice.Theexperimentwasrepeatedthreetimestoobtainconsistentresults.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantdifferencesinmultiplecomparisonsofdata(P<0.05).Theexperimentwasrepeatedthreetimes,eachyieldingsimilarresults.3.2WY172驅(qū)動HpaXm基因在煙草中的穩(wěn)定表達3.2.1植物表達載體pBI121-172-HpaXm的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得將pBI121-WY172及陽性對照pBI121載體中的報告基因GUS替換為HpaXm基因，獲得了新的植物表達載體pBI121-WY172-HpaXm。并通過ATMT方法將pBI121-WY172-HpaXm及pBI121-HpaXm整合到了煙草基因組中，獲得T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株（圖4，A）。篩選了可能包含WY172和HpaXm的26

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