棉花黃萎病防治技術及兩個抗病相關基因功能研究
發(fā)布時間：2021-03-29 05:37
棉花不僅是我國人民衣著和紡織工業(yè)的主要原料,還是出口創(chuàng)匯的重要產品,關系國計民生,意義重大。而棉花黃萎病廣泛分布于世界五大洲的各產棉區(qū),嚴重威脅著棉花的可持續(xù)生產。黃萎病菌可通過突變、異核現(xiàn)象等引起變異,土壤、種子、病殘體、棉籽殼和棉籽餅等都可作其傳播途徑,這使其防治較為困難。目前,通過分子手段進行抗病育種是防治該病害的理想措施。本研究制訂了棉花黃萎病的田間防治技術并在田間實驗基地對該技術進行了防治效果鑒定;以抗黃萎病品種中植棉KV-3作為植物材料,以強致病力菌株大麗輪枝菌V991作為接種病菌,篩選抗黃萎病相關基因;利用RACE和電子克隆等技術得到抗病基因全長;通過亞細胞定位技術和超表達技術分析目的基因的定位及功能。取得結果如下:1.以不采取任何措施和只使用生防制劑拌種作對照,研究棉花黃萎病田間防治技術的防效。實驗結果顯示,采用生防制劑拌種、施加有機肥、噴施葉面肥和控制早鈴相結合的措施,具有防病增產效果。2.利用VIGS技術在中植棉KV-3中成功沉默了基因GhFLS2、GhMRH1、GhAGD13和GhWRKY29,對沉默植株進行抗病性測定發(fā)現(xiàn),GhFLS2、GhMRH1、GhAGD1...
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：84 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
田間棉花黃萎病癥狀（簡桂良攝）
農業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 VIGS 技術鑒定抗黃萎病相關分別摘取野生型、轉空載體 pCLCrV(A+B)、pCLCrV-GhAGD13 和 pCLCrV-GhWRKY29 葉菌水沖洗干凈后放入小燒杯中；向燒杯中加入苔盼藍染色液，用沸水煮 8-10 分鐘染色；液，用水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脫色；完成脫色后，觀察并拍照留存。3. 實驗結果.1. 沉默載體的構建沉默載體 pCLCrVA 中所插入的目標基因的大小會直接影響到目標基因的沉默效率，如段過長會妨礙病毒沉默載體在植物中的移動，Burch-Smith 等（2004）通過研究報道，中的插入片段在 300bp 到 500bp 之間效果最好。在本研究中，目標基因的片段均在這個圖 3-1 A）；目的片段連接中間載體后，通過雙酶切獲得了目的基因片段（圖 3-1 B）；的基因片段，連接載體后用菌落 PCR 篩選（圖 3-1 C），酶切驗證 VIGS 載體（圖 3-1 D農桿菌后，菌落 PCR 鑒定（圖 3-1 E）。A. B.
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 VIGS 技術鑒定抗黃萎病相關基因1-4:GhFLS2(352 bp); 5-8: GhMRH1(342 bp); 9-12: GhAGD13(412 bp); 13-16: GhWRKY29(310 bp). B: Intermediate vector enzymedigestion M: 200 bp marker 1-3: GhFLS2; 4-6: GhAGD13; 7-9: GhMRH1; 10-12: GhWRKY29. C: Silent vector colony PCR M: 20bp marker 1-6: GhFLS2; 7-11: GhAGD13; 12-15: GhMRH1; 16-19: GhWRKY29. D: Silent vector enzyme digestion verification M: 20bp marker 1: GhFLS2; 2: GhMRH1; 3: GhAGD13; 4: GhWRKY29. E:Agrobacterium colony PCR M: 200 bp marker 1-4: GhMRH5-8: GhWRKY29; 9-14: GhAGD13; 15-21: GhFLS2.3.3.2. VIGS 技術沉默 GhCLAIGhCLAI 是棉花葉綠素合成過程中所需要的關鍵基因，缺少該基因棉株會出現(xiàn)白化癥狀。研究使用子葉注射的方法將 pCLCrVA-GhCLAI-pCLCrVB 注射接種棉株后，約 20 天左右該處的棉株新生葉片首先出現(xiàn)白化的現(xiàn)象，之后整個棉株逐漸白化，而野生型對照和接種空載pCLCrV（A+B）的棉株正常生長且未曾出現(xiàn)白化現(xiàn)象，說明該病毒沉默載體 pCLCrV（A+B）以成功沉默掉目標基因且對棉株的正常生長無影響（圖 3-2）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]擬南芥轉錄因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鑒定[J]. 李琪,李燁,牛芳芳,郭小華,趙新杰,吳相民,楊博,江元清. 農業(yè)生物技術學報. 2019(02)
[2]AcCBF1轉錄因子沉默對低溫脅迫下扁桃花器官的影響[J]. 宋恬,李鵬,田嘉,劉夢婕,張琦,李疆. 經濟林研究. 2019(01)
[3]葛棗獼猴桃果糖激酶基因電子克隆和生物信息學分析[J]. 任偉超,李陽,郝錕,張巍,許忠海,馬偉. 中國藥師. 2019(01)
[4]玉米ZmRINO1基因鹽堿逆境脅迫下的表達及生物信息學分析[J]. 呂慶雪,何歡,高嵩,牛銘晨,孫蕾,李毅丹,張建新,王敏,宋廣樹,劉文國. 分子植物育種. 2019(19)
[5]鈣依賴性蛋白激酶34在小麥籽粒淀粉合成的功能[J]. 徐夢軍,高天,王鵬飛,李鴿子,康國章. 中國農業(yè)科技導報. 2019(02)
[6]LeETR4沉默對番茄果實成熟的影響[J]. 張策,謝遠紅,朱本忠. 食品科技. 2018(11)
[7]棉花GhTGA1與GhTGA9.2基因克隆及表達特征分析[J]. 趙曾強,李瀟玲,張析,張薇,練文明. 華北農學報. 2018(05)
[8]棉花ERF-B3亞組轉錄因子基因GhERF5-1的克隆及表達[J]. 郭文婷,張鵬飛,李瀟玲,張析,張薇. 江蘇農業(yè)科學. 2018(19)
[9]VIGS誘導SL-ZH22基因沉默下番茄耐鹽性研究[J]. 李景富,張曉春,姜景彬,楊歡歡,趙婷婷,許向陽. 東北農業(yè)大學學報. 2018(10)
[10]水稻OsLecRK基因的亞細胞定位分析[J]. 閘雯俊,楊芳,張艷茗,游艾青. 湖北農業(yè)科學. 2018(17)
博士論文
[1]利用VIGS技術研究棉花抗逆基因功能[D]. 李芳軍.中國農業(yè)大學 2014
[2]陸地棉抗黃萎病相關基因篩選及功能驗證[D]. 張文蔚.中國農業(yè)科學院 2013
碩士論文
[1]GhMAPK和GhMAPKK在棉花應答鏈格孢抗性中的作用[D]. 高環(huán).中國農業(yè)科學院 2018
[2]VIGS技術解析陸地棉抗黃萎病相關基因及GhB2功能初步鑒定[D]. 張華崇.中國農業(yè)科學院 2016
[3]棉花抗黃萎病相關基因GhSKIP35基因的克隆與功能驗證[D]. 劉凱.中國農業(yè)科學院 2015
[4]大麗輪枝菌病程相關基因的篩選及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探[D]. 齊希梁.中國農業(yè)科學院 2013
本文編號：3107008
【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：84 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
田間棉花黃萎病癥狀（簡桂良攝）
農業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 VIGS 技術鑒定抗黃萎病相關分別摘取野生型、轉空載體 pCLCrV(A+B)、pCLCrV-GhAGD13 和 pCLCrV-GhWRKY29 葉菌水沖洗干凈后放入小燒杯中；向燒杯中加入苔盼藍染色液，用沸水煮 8-10 分鐘染色；液，用水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脫色；完成脫色后，觀察并拍照留存。3. 實驗結果.1. 沉默載體的構建沉默載體 pCLCrVA 中所插入的目標基因的大小會直接影響到目標基因的沉默效率，如段過長會妨礙病毒沉默載體在植物中的移動，Burch-Smith 等（2004）通過研究報道，中的插入片段在 300bp 到 500bp 之間效果最好。在本研究中，目標基因的片段均在這個圖 3-1 A）；目的片段連接中間載體后，通過雙酶切獲得了目的基因片段（圖 3-1 B）；的基因片段，連接載體后用菌落 PCR 篩選（圖 3-1 C），酶切驗證 VIGS 載體（圖 3-1 D農桿菌后，菌落 PCR 鑒定（圖 3-1 E）。A. B.
中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 VIGS 技術鑒定抗黃萎病相關基因1-4:GhFLS2(352 bp); 5-8: GhMRH1(342 bp); 9-12: GhAGD13(412 bp); 13-16: GhWRKY29(310 bp). B: Intermediate vector enzymedigestion M: 200 bp marker 1-3: GhFLS2; 4-6: GhAGD13; 7-9: GhMRH1; 10-12: GhWRKY29. C: Silent vector colony PCR M: 20bp marker 1-6: GhFLS2; 7-11: GhAGD13; 12-15: GhMRH1; 16-19: GhWRKY29. D: Silent vector enzyme digestion verification M: 20bp marker 1: GhFLS2; 2: GhMRH1; 3: GhAGD13; 4: GhWRKY29. E:Agrobacterium colony PCR M: 200 bp marker 1-4: GhMRH5-8: GhWRKY29; 9-14: GhAGD13; 15-21: GhFLS2.3.3.2. VIGS 技術沉默 GhCLAIGhCLAI 是棉花葉綠素合成過程中所需要的關鍵基因，缺少該基因棉株會出現(xiàn)白化癥狀。研究使用子葉注射的方法將 pCLCrVA-GhCLAI-pCLCrVB 注射接種棉株后，約 20 天左右該處的棉株新生葉片首先出現(xiàn)白化的現(xiàn)象，之后整個棉株逐漸白化，而野生型對照和接種空載pCLCrV（A+B）的棉株正常生長且未曾出現(xiàn)白化現(xiàn)象，說明該病毒沉默載體 pCLCrV（A+B）以成功沉默掉目標基因且對棉株的正常生長無影響（圖 3-2）。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]擬南芥轉錄因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鑒定[J]. 李琪,李燁,牛芳芳,郭小華,趙新杰,吳相民,楊博,江元清. 農業(yè)生物技術學報. 2019(02)
[2]AcCBF1轉錄因子沉默對低溫脅迫下扁桃花器官的影響[J]. 宋恬,李鵬,田嘉,劉夢婕,張琦,李疆. 經濟林研究. 2019(01)
[3]葛棗獼猴桃果糖激酶基因電子克隆和生物信息學分析[J]. 任偉超,李陽,郝錕,張巍,許忠海,馬偉. 中國藥師. 2019(01)
[4]玉米ZmRINO1基因鹽堿逆境脅迫下的表達及生物信息學分析[J]. 呂慶雪,何歡,高嵩,牛銘晨,孫蕾,李毅丹,張建新,王敏,宋廣樹,劉文國. 分子植物育種. 2019(19)
[5]鈣依賴性蛋白激酶34在小麥籽粒淀粉合成的功能[J]. 徐夢軍,高天,王鵬飛,李鴿子,康國章. 中國農業(yè)科技導報. 2019(02)
[6]LeETR4沉默對番茄果實成熟的影響[J]. 張策,謝遠紅,朱本忠. 食品科技. 2018(11)
[7]棉花GhTGA1與GhTGA9.2基因克隆及表達特征分析[J]. 趙曾強,李瀟玲,張析,張薇,練文明. 華北農學報. 2018(05)
[8]棉花ERF-B3亞組轉錄因子基因GhERF5-1的克隆及表達[J]. 郭文婷,張鵬飛,李瀟玲,張析,張薇. 江蘇農業(yè)科學. 2018(19)
[9]VIGS誘導SL-ZH22基因沉默下番茄耐鹽性研究[J]. 李景富,張曉春,姜景彬,楊歡歡,趙婷婷,許向陽. 東北農業(yè)大學學報. 2018(10)
[10]水稻OsLecRK基因的亞細胞定位分析[J]. 閘雯俊,楊芳,張艷茗,游艾青. 湖北農業(yè)科學. 2018(17)
博士論文
[1]利用VIGS技術研究棉花抗逆基因功能[D]. 李芳軍.中國農業(yè)大學 2014
[2]陸地棉抗黃萎病相關基因篩選及功能驗證[D]. 張文蔚.中國農業(yè)科學院 2013
碩士論文
[1]GhMAPK和GhMAPKK在棉花應答鏈格孢抗性中的作用[D]. 高環(huán).中國農業(yè)科學院 2018
[2]VIGS技術解析陸地棉抗黃萎病相關基因及GhB2功能初步鑒定[D]. 張華崇.中國農業(yè)科學院 2016
[3]棉花抗黃萎病相關基因GhSKIP35基因的克隆與功能驗證[D]. 劉凱.中國農業(yè)科學院 2015
[4]大麗輪枝菌病程相關基因的篩選及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探[D]. 齊希梁.中國農業(yè)科學院 2013
本文編號：3107008
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