楊樹(shù)是世界范圍內(nèi)具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的樹(shù)種之一,也是林木遺傳的模式樹(shù)種。由落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）引起的葉銹病是楊樹(shù)苗期和幼樹(shù)階段的重要葉部病害,常造成楊樹(shù)生產(chǎn)上很大的損失。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)20²5 nt的小分子單鏈非編碼RNA,植物中的miRNA主要通過(guò)miRNA與序列互補(bǔ)來(lái)切割靶mRNA,從而介導(dǎo)靶mRNA的降解以抑制靶基因的表達(dá),進(jìn)而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)。研究miRNA有助于揭示很多生命現(xiàn)象的分子機(jī)理,并有助于作物和林木的遺傳改良。本論文通過(guò)對(duì)前期miRNA高通量測(cè)序中預(yù)測(cè)出的與抗銹病相關(guān)的兩個(gè)novel miRNAs進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其靶基因進(jìn)行切割驗(yàn)證、全長(zhǎng)擴(kuò)增以及基因功能預(yù)測(cè),構(gòu)建miRNA前體基因的過(guò)表達(dá)載體,以便通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入楊樹(shù)體內(nèi),從而深入了解楊樹(shù)受病原菌侵染時(shí)miRNA的功能。具體研究結(jié)果如下:1.受落葉松-楊柵銹菌侵染的川楊novel miRNAs檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了非親和與親和性楊樹(shù)-柵銹菌互作條件下的楊樹(shù)sRNA文庫(kù),本試驗(yàn)從高通量測(cè)序得到nove... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 楊樹(shù)葉銹病概述
        1.1.1 楊樹(shù)葉銹病的發(fā)生與危害
        1.1.2 落葉松-楊柵銹菌
        1.1.3 楊樹(shù)對(duì)落葉松-楊柵銹菌的抗性
    1.2 miRNA概述
        1.2.1 植物miRNA的起源與產(chǎn)生
        1.2.2 植物miRNA的作用機(jī)制
    1.3 植物miRNA對(duì)脅迫的響應(yīng)
        1.3.1 植物miRNA對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)
        1.3.2 植物miRNA對(duì)生物脅迫的響應(yīng)
    1.4 植物miRNA靶標(biāo)基因的研究
        1.4.1 靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)
        1.4.2 靶基因的驗(yàn)證
    1.5 楊樹(shù)miRNA研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的與意義
第二章 novel miRNA檢測(cè)及靶基因切割驗(yàn)證
    2.1 材料、試劑和儀器
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 試驗(yàn)試劑和儀器
        2.1.3 試劑配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 川楊接種
        2.2.2 總RNA提取
        2.2.3 cDNA第一條鏈的合成
mir₁1和novel_mir₃57 的檢測(cè)">        2.2.4 novel_mir₁1和novel_mir₃57 的檢測(cè)
        2.2.5 RLM-5’RACE驗(yàn)證novel miRNA對(duì)其靶基因的切割
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        2.3.2 銹菌接種后反應(yīng)型觀察
mir₁1和novel_mir₃57 檢測(cè)結(jié)果">        2.3.3 novel_mir₁1和novel_mir₃57 檢測(cè)結(jié)果
        2.3.4 RLM-5’RACE驗(yàn)證novel miRNA對(duì)其靶基因的切割
    2.4 討論
第三章 靶基因的全長(zhǎng)克隆和表達(dá)分析
    3.1 材料、試劑與儀器
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 試劑與儀器
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 中間片段的PCR擴(kuò)增
        3.2.2 RACE-Ready cDNA合成
        3.2.3 RACE擴(kuò)增3’和5’端
        3.2.4 PCR產(chǎn)物切膠回收
        3.2.5 RACE產(chǎn)物的In-Fusion克隆
        3.2.6 全長(zhǎng)的拼接和序列結(jié)構(gòu)分析
        3.2.7 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析
        3.2.8 侵染不同菌系后不同時(shí)間段novel miRNAs與靶基因的表達(dá)檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 中間片段的擴(kuò)增及克隆
        3.3.2 5 ’和3’端擴(kuò)增
        3.3.3 靶基因全長(zhǎng)的獲得與分析
        3.3.4 基因的生物信息學(xué)分析
        3.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建
        3.3.6 novel miRNA與靶基因表達(dá)檢測(cè)
    3.4 討論
第四章 pze-miR11 前體基因的表達(dá)載體構(gòu)建
    4.1 材料、試劑與儀器
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 試驗(yàn)試劑
        4.1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 川楊基因組DNA的提取
mir₁1 前體基因的克隆">        4.2.2 川楊novel_mir₁1 前體基因的克隆
        4.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 基因組DNA的提取和前體基因的擴(kuò)增
        4.3.2 前體基因序列的比對(duì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
        4.3.3 質(zhì)粒提取和雙酶切
        4.3.4 重組載體的驗(yàn)證
        4.3.5 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的PCR驗(yàn)證
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
[1]毛白楊低溫脅迫相關(guān)microRNAs的鑒定及差異表達(dá)分析[D]. 張譯云.北京林業(yè)大學(xué) 2012



本文編號(hào)：2940567