小菜蛾(Plutella xylostella)是一種世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的害蟲(chóng),其主要為害十字花科植物。本研究主要對(duì)幾丁質(zhì)合成酶1基因PxCHS1進(jìn)行了功能分析。通過(guò)用細(xì)菌表達(dá)的靶dsRNA(dsPxCHS1)飼喂小菜蛾幼蟲(chóng)來(lái)研究幾丁質(zhì)合成酶1的基因沉默效果�；虮磉_(dá)分析表明,幾丁質(zhì)合酶1及其兩種變體在不同的組織及不同的生命階段均有相似的表達(dá)模式,但表達(dá)量存在差異,表明在不用組織及不同發(fā)育階段對(duì)幾丁質(zhì)合成酶的調(diào)控存在差異。使用RNAi對(duì)目標(biāo)基因的4個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行干擾,結(jié)果表明,干擾靶基因的5’和3’端具有較好的效果,干擾5’端效果最好。生測(cè)結(jié)果表明,連續(xù)給小菜蛾飼喂dsRNA 4天后,幼蟲(chóng)的死亡率與對(duì)照相比增加了約50%。飼喂dsRNA導(dǎo)致蛹的表型異常且延長(zhǎng)了蛹期。由于飼喂dsRNA,蛹的尾部附著在幼蟲(chóng)體上從而干擾了蛹的羽化。與對(duì)照相比,處理組的羽化率下降43.33%,而幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段沒(méi)有形態(tài)學(xué)差異。qPCR結(jié)果表明,喂食特異性的幾丁質(zhì)合酶基因dsRNA導(dǎo)致相對(duì)基因表達(dá)水平低于對(duì)照,具體表現(xiàn)為在喂食后24小時(shí),基因表達(dá)水平比對(duì)照減少53.5%,然而,在喂食48小時(shí)后,其相對(duì)表達(dá)水平卻上升,表明攝入的RNAi的瞬時(shí)效應(yīng)。通過(guò)對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行Illumina測(cè)序后發(fā)現(xiàn)了1348個(gè)新基因,并在COG(140)、GO(406)、KEGG(308)、KOG(488)、Pfam(573)、Swiss-Prot(402)、eggNOG(1003)和nr(1335)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明,RNA降解和剪接體途徑相關(guān)基因、Lsm蛋白在飼喂dsPxCHS1的幼蟲(chóng)中下調(diào),表明減少了mRNA的降解。但要明確dsPxCHS1的對(duì)小菜蛾基因表達(dá)調(diào)控的影響,尚需進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S433.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
Abbreviations
CHAPTER 1: RNAi for gene functional analysis and pest control, a Review
    1 Introduction
    2 Biology, Ecology and Management of Diamondback moth
        2.1 Diamondback moth: A Chinese perspective
        2.2 Basic biology
        2.3 General life cycle
        2.4 Current DBM management strategies
        2.5 Environmental friendly integrated pest approaches -Biological control of DBM
    3 Chitin synthases in Insects
        3.1 Regulation of insect chitin synthases
    4 RNA interference
        4.1 RNAi pathways and mechanism
        4.2 RNAi for insect pest management
        4.3 Factors affecting RNAi efficiency
    5 RNAi for gene functional analysis
CHAPTER 2: Gene cloning and Functioanl analysis of chitin synthase gene1
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 Insects
        2.2 Vectors
        2.3 Gene
        2.4 Enzymes and Kits
        2.5 Microbiological media
        2.6 Stock solutions
        2.7 Main reagents for plasmid extraction
        2.8 Gene cloning
        2.9 Polymerase Chain Reaction
        2.10 Gel Electrophoresis and Purification
        2.11 Ligation
        2.12 Preparation of competent cells for transformation
        2.13 Confirmation of transformed bacteria by PCR and Plasmid digestion
        2.14 ds RNA vector construction
        2.15 IPTG induction for ds RNA production
        2.16 RNA digest
        2.17 Bioassay of the transformed bacteria expressing ds RNA
        2.18 Gene expression analysis
        2.19 Statistics and Data analysis
    3 Results
        3.1 Gene cloning
        3.2 Gene expression analysis of Px CHS1
        3.3 ds RNA production confirmation in bacteria
        3.4 Effect of ds RNA feeding on DBM larvae mortality
        3.5 Effect on growth parameters
        3.6 Effect of ds RNA feeding time on gene expression
    4 Conclusion
CHAPTER 3: Differential gene expression analysis upon ds RNA feeding
    1 Introduction
    2 Materials and methods
        2.1 ds RNA feeding and sample preparation for RNA- seq
        2.2 RNA isolation c DNA library construction and Illumina sequencing
        2.3 De Novo transcriptome assembly, annotation and differential expression analysis
    3 Results
        3.1 Sequencing and de novo assembly of the P. xylostella transcriptome and differential geneexpression analysis
        3.2 Functional annotation
        3.3 Gene ontology （GO） and clusters of orthologous groups （COG） classification
        3.4 Functional annotation of differentially expressed genes （DEGs）
    4 Conclusion
CHAPTER 4: General Discussion and Conclusion
    4.1 Discussion
    4.2 Conclusion
Reference
Acknowledgements
Author information

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本文編號(hào)：2851074