大豆孢囊線蟲(chóng)(SCN)是我國(guó)大豆產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的病害之一,嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì),已成為制約我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。本研究選用ISSRs分子標(biāo)記技術(shù),將從核DNA水平研究中國(guó)境內(nèi)大豆孢囊線蟲(chóng)17個(gè)不同地理種群的遺傳多樣性及遺傳分化水平,從而闡明大豆孢囊線蟲(chóng)在中國(guó)的傳播與擴(kuò)散機(jī)制,為大豆孢囊線蟲(chóng)病的可持續(xù)控制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)2009年~2017年在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西、河南、江蘇、安徽、湖北、浙江、福建、江西、廣東、廣西、貴州等17省116縣開(kāi)展大豆孢囊線蟲(chóng)病害調(diào)查,共采集336份樣土,其中16省105縣256份樣土有孢囊線蟲(chóng)檢出,總檢出率為76.20%。我國(guó)東北大豆產(chǎn)區(qū)齊齊哈爾孢囊密度最大,孢囊數(shù)達(dá)366.8個(gè)/200g土,其次為松原283.0個(gè)/200g土;黃淮地區(qū)山西孢囊檢出數(shù)量最多,平均孢囊數(shù)為28.3/200g土;華南等地為零星分布,偶有發(fā)生,平均孢囊數(shù)為0.8~3.5個(gè)/200g土。(2)分離獲得19個(gè)種群孢囊線蟲(chóng),經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定,認(rèn)定17個(gè)種群為大豆孢囊線蟲(chóng),2個(gè)種群為旱稻孢囊線蟲(chóng),擴(kuò)增146頭孢囊的rDNA-ITS區(qū),測(cè)序并上傳NCBI注冊(cè),用Neighbor-Joining方法聚類建樹(shù),17個(gè)群體與大豆孢囊線蟲(chóng)親緣相似度達(dá)98%,2個(gè)種群與旱稻孢囊線蟲(chóng)為同一分支,與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。從ITS分子特征上,17個(gè)大豆孢囊線蟲(chóng)群體ITS片段的差異小于2%,2個(gè)旱稻孢囊線蟲(chóng)群體ITS片段的差異小于1%,表明ITS用于孢囊線蟲(chóng)的分類合適,是孢囊線蟲(chóng)DNA條形碼的潛在選擇基因,種群間遺傳多樣性與遺傳分化無(wú)法體現(xiàn)。(3)通過(guò)參考文獻(xiàn)選定12條ISSRs引物,篩選出對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)擴(kuò)增清晰,多態(tài)性較多引物,最終確定3條引物PTY26、PTY188和PTY888擴(kuò)增效果較好,同時(shí)建立大豆孢囊線蟲(chóng)ISSRs體系并對(duì)各反應(yīng)因素優(yōu)化。結(jié)果表明當(dāng)PCR總體系為25μL,dNTPs用量為1.5μL、引物用量為0.8μL、DNA模板用量為1.2μL、DNA Taq聚合酶用量為0.34μL、10×PCR Buffer(Mg~(2+)plus)用量為2.5μL;退火溫度55℃時(shí)條帶較明顯且清晰,擴(kuò)增效果較好,該反應(yīng)體系可獲得大豆孢囊線蟲(chóng)ISSRs清晰且多態(tài)性高的圖譜以便后續(xù)研究分析。(4)統(tǒng)計(jì)135頭孢囊屬于14個(gè)地理種群,3條引物共擴(kuò)增58條譜帶,50條為多態(tài)性條帶,多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為86.21%。引物PTY26、PTY188和PTY888分別擴(kuò)增不同長(zhǎng)度條帶18、19、21條,多態(tài)性條帶分別15、16、19條,多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為83.33%、84.21%、90.48%。結(jié)果表明供試線蟲(chóng)材料有很好的ISSRs多態(tài)性。(5)對(duì)供試SCN計(jì)算遺傳距離得出聚類圖,并進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明:本試驗(yàn)中14個(gè)地理種群SCN遺傳距離范圍為0.0984~0.4098,齊齊哈爾和大慶的遺傳相似度最低,遺傳距離最大;內(nèi)蒙古扎蘭屯和松原的遺傳相似度最高,遺傳距離最小。通過(guò)軟件計(jì)算出遺傳相關(guān)數(shù)據(jù),有效等位基因數(shù)(Ne)為1.3377,Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)為0.2087,Shannon’s多樣性指數(shù)(I)為0.3287;14個(gè)種群總的遺傳多樣性Ht指數(shù)為0.2087,種群內(nèi)遺傳多樣性Hs指數(shù)為0.0648,基因分化系數(shù)Gst指數(shù)為0.6893,表明大豆孢囊線蟲(chóng)的遺傳變異主要存在于種群間,基因流Nm為0.2255,說(shuō)明不同地理群體間基因交流較少。進(jìn)行多態(tài)性分析后表明,試驗(yàn)所用SCN種群間地理距離不能作為遺傳距離的依據(jù),且14個(gè)種群間和種群內(nèi)有較高的遺傳分化和遺傳多樣性。本研究結(jié)果對(duì)闡明大豆孢囊線蟲(chóng)的進(jìn)化機(jī)理、研究大豆孢囊線蟲(chóng)的生理小種及毒力變化研究具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.651
【部分圖文】：

作兩年的樣品孢囊檢出數(shù)量為 61 個(gè)/200g 土；晉城 4 份樣品采集自不 919.3m 的樣品孢囊檢出數(shù)量最多，達(dá) 96 個(gè)/200g 土，其余 3 份均小于 5 份樣品耕作方式均為輪作（前茬玉米），其中種植蒙豆 13 品種孢囊植蒙豆 1137 品種最少。品中各大豆種植品種、各耕作方式均有孢囊檢出。土壤類型有黑鈣土、草甸土、沙壤土、腐殖土、沖積土、白漿土、草炭土，均有孢囊檢中的居多，草炭土其次，兩份草甸土孢囊數(shù)差距較大，估計(jì)和種植品沖積土和腐殖土中最少。1，本試驗(yàn)調(diào)查點(diǎn)中黑龍江西部（齊齊哈爾、大慶市）、吉林北部（松公主嶺）等地孢囊密度大，達(dá)到 200.0 個(gè)/200g 土以上，其中齊齊哈個(gè)/200g 土，孢囊密度最大，對(duì)大豆產(chǎn)量損失及其嚴(yán)重；吉林省西北中部偏南（遼源市）、河北省東部（滄州市）、山東省中部（泰安市）、江蘇省西北部（徐州市）、安徽省北部（宿州市）、湖北省中部偏省北部（杭州市）、福建省中部（三明市）、廣東省中部（廣州市）、安順市）樣品孢囊線蟲(chóng)數(shù)在 2.0 個(gè)/200g 土以下，危害相對(duì)較輕。

最后延伸步驟 72℃ 10min最后保存溫度 4℃提取的 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并設(shè)置無(wú) DNA 的陰性對(duì)照；擴(kuò)增后，取 5μL PC 1μL 6×Loading Buffer 充分混合，在 1%的瓊脂糖凝膠上 100V 電泳 40 min，用 1μL 4S Green Plus Nucleic Acid Stain 進(jìn)行染色，用 DL 2000 DNA maker（p）作為凝膠條帶的標(biāo)記，電泳緩沖液為 1×TAE，之后在 Bio-RAD 凝膠成像拍照和保存。有清晰明亮條帶的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序、拼 上進(jìn)行序列比對(duì)并上傳至 GenBank，得到序列登錄號(hào)。結(jié)果 ITS 擴(kuò)增結(jié)果驗(yàn)在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)飽滿線蟲(chóng)樣品 rDNA-ITS 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，舍棄條帶不清晰多個(gè)條帶的線蟲(chóng)樣品，最終成功擴(kuò)增出 146 頭孢囊線蟲(chóng) rDNA-ITS 區(qū)，部分圖如圖 2.1，擴(kuò)增得到約 1000bp 長(zhǎng)度明亮整齊的條帶，條帶明亮說(shuō)明 DNA 合之后的 ISSRs 試驗(yàn)。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3.2 使用引物 PTY26 不同退火溫度的 ISSRs 擴(kuò)增試M：DL 2000 maker；1-4：49℃，52℃，55℃，58℃。2 ISSRs amplification of Anneal Temperature by PTY26nes M:DL2000 DNA marker;Lanes 1-4:49℃ ,52℃ ,55℃ ,5NTPs、Taq 聚合酶、引物、DNA 模板四因素進(jìn)增結(jié)果得到一個(gè)較為直觀的對(duì)比，如圖 3.3 所示出條帶越不清晰，用量在 1.0μL～1.5μL 時(shí)效果較時(shí)效果相對(duì)較好；Taq DNA 聚合酶用量為 0.2μL好；模版 DNA 用量對(duì)擴(kuò)增效果無(wú)明顯影響。擴(kuò) dNTPs 1.5μL、Taq 聚合酶 0.3μL、引物 1.0μLTY26。3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2849028