發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 21:30

　　 昆蟲的天然免疫分為細(xì)胞免疫(cellularimmunity)和體液免疫(humoral immunity)。昆蟲的細(xì)胞免疫是指多種血細(xì)胞參與的防衛(wèi)反應(yīng),包括吞噬作用(cytophagy)、結(jié)節(jié)形成(nodulation)和細(xì)胞包囊(encapsulation);體液免疫涉及抗菌肽的誘導(dǎo)、酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)激活導(dǎo)致的黑化反應(yīng)(melanization)。絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor,Serpin),是血淋巴中對(duì)絲氨酸蛋白酶有抑制作用的一類蛋白質(zhì),用來調(diào)節(jié)昆蟲內(nèi)環(huán)境的平衡。β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白(β-1,3-glucanrecognitionprotein,βGRP)作為一種模式識(shí)別蛋白,能夠識(shí)別真菌的細(xì)胞壁成分,在昆蟲的免疫系統(tǒng)中占有重要地位。本文利用RT-PCR和RACE擴(kuò)增技術(shù),克隆了亞洲玉米螟幼蟲Serpin2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因全長(zhǎng)1447bp核苷酸,其中包含一個(gè)1137bp的開放閱讀框(ORF),一個(gè)163 bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和一個(gè)147bp的帶有加尾信號(hào)的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。開放閱讀框從第164個(gè)核苷酸開始,終止于第1300個(gè)核苷酸,共編碼378個(gè)氨基酸。Of-Serpin2的計(jì)算分子量約為41.71kDa,估測(cè)等電點(diǎn)pI為5.29。生物信息學(xué)分析表明:Of-Serpin2無跨膜結(jié)構(gòu)域,N端無信號(hào)肽,不存在糖基化位點(diǎn),含有39個(gè)磷酸化位點(diǎn),均勻分布于整個(gè)多肽鏈中。BlastP分析結(jié)果表明:Of-Serpin2的氨基酸序列與尺蠖Lonomia obliqua Serpin2、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua Serpin2、野桑蠶 Bombyx mandarina Serpin2、家蠶 Bombyx mori Serpin2、大斑蝶Daanaus plexippus Serpin2高度同源。三維結(jié)果顯示,Of-Serpin2有8個(gè)α螺旋,3個(gè)β折疊。利用RNA干擾技術(shù),研究干擾βGRP3基因后亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)與體液免疫相關(guān)基因Serpin1、PAP、PPO等的表達(dá)情況,以及對(duì)細(xì)胞免疫能力的初步影響。以DEPC水處理組和綠色熒光報(bào)告蛋白(GFP)處理組為陰性對(duì)照,制備了βGRP3和GFP的dsRNA,采用注射方法,分別將βGRP3和陰性對(duì)照GFP的dsRNA導(dǎo)入4齡初亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RNAi后幼蟲體內(nèi)Serpin1、PPO、PAP等免疫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化,進(jìn)一步分析RNAi對(duì)血淋巴中PO活性的影響,探索βGRP3在亞洲玉米螟免疫識(shí)別和防衛(wèi)過程中的功能。結(jié)果表明:將βGRP3基因干擾后72h,亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)該基因的表達(dá)量開始明顯降低(P0.05),表明注射βGRP3dsRNA可以有效下調(diào)βGRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平。與此同時(shí),其免疫相關(guān)基因PAP(酚氧化酶原激活蛋白酶)、PPO(酚氧化酶原)的表達(dá)量也顯著低于對(duì)照;干擾后幼蟲體內(nèi)PO酶活性在72 h開始呈現(xiàn)顯著下調(diào),這表明Of-βGRP3正調(diào)控PO活性,即在PPO級(jí)聯(lián)調(diào)控中起重要作用。對(duì)干擾后亞洲玉米螟幼蟲血細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn),72h開始,類絳色細(xì)胞、漿血細(xì)胞和原血細(xì)胞的數(shù)量開始下降(P0.05),而粒血細(xì)胞數(shù)量增加,且漿血細(xì)胞在96 h后的數(shù)量開始回升,同時(shí)與對(duì)照組相比,處理組的總細(xì)胞數(shù)并沒有發(fā)生明顯變化(P0.05),說明宿主昆蟲在受到外來入侵物影響時(shí),其血細(xì)胞會(huì)自行進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),以維持宿主昆蟲體內(nèi)的正常生理活動(dòng)。RNAi后再次注射細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)只注射大腸桿菌處理組的致死中時(shí)間(3d)顯著大于RNAi處理后二次注菌處理組(1 d),結(jié)果表明:βGRP3在昆蟲抵抗病原菌侵染中起重要作用。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.132
【部分圖文】：

３．１．１?（９／－—／？２?基因全長(zhǎng)?ｃＤＮＡ?序列的?３ｒ－ＲＡＣＥ?和?５ＬＲＡＣＥ??在己知的中間片段基因序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性的引物，利用３＇－ＲＡＣＥ進(jìn)彳丁?ｃＤＮＡ末端??快速擴(kuò)增，３ＬＲＡＣＥ通過兩對(duì)不同引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度均為６００?ｂｐ?（圖１．３、圖１．５）。??將目標(biāo)條帶割膠回收，連接ＰＭＤ－１８Ｔ載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)ＴｏｐｌＯ感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，單??克隆挑斑鑒定結(jié)果如下圖（圖１．４、圖１．６）。５＇－ＲＡＣＥ通過引物擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度約為１２００?ｂｐ??（圖１．７），單克隆挑斑鑒定如下圖（圖１．８）。??ｂｐ?１?２?３??＿纖＿議＿議＿＿＿＿＿議＿＿＿＾??２?鋪（Ｉ?—??４鄕?Ｊ?：?ｂ—＾＾ｎｌ??扉??圖１．３亞洲玉米螟幼蟲＆７７如２基因的第一次３＇－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－３，３＇－ＲＡＣＥＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?．一一＿馨、暴豪：端＇瀘??１０００?＂?；?％§ｆ?＾?ｌｌ???＿＿?ＯｆＳｅｒｐｉＢｌ??５００?變靡？蕾心實(shí)??２５０??售??１００?■?Ｅ，?＇贏爲(wèi)＿蠢ｆ廠甚??圖１．４亞洲玉米螟幼蟲＆ｒ；？／？２基因的Ｔ－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物菌落ＰＣＲ鑒定??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－５，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??

３．１．１?（９／－—／？２?基因全長(zhǎng)?ｃＤＮＡ?序列的?３ｒ－ＲＡＣＥ?和?５ＬＲＡＣＥ??在己知的中間片段基因序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性的引物，利用３＇－ＲＡＣＥ進(jìn)彳丁?ｃＤＮＡ末端??快速擴(kuò)增，３ＬＲＡＣＥ通過兩對(duì)不同引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度均為６００?ｂｐ?（圖１．３、圖１．５）。??將目標(biāo)條帶割膠回收，連接ＰＭＤ－１８Ｔ載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)ＴｏｐｌＯ感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，單??克隆挑斑鑒定結(jié)果如下圖（圖１．４、圖１．６）。５＇－ＲＡＣＥ通過引物擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度約為１２００?ｂｐ??（圖１．７），單克隆挑斑鑒定如下圖（圖１．８）。??ｂｐ?１?２?３??＿纖＿議＿議＿＿＿＿＿議＿＿＿＾??２?鋪（Ｉ?—??４鄕?Ｊ?：?ｂ—＾＾ｎｌ??扉??圖１．３亞洲玉米螟幼蟲＆７７如２基因的第一次３＇－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－３，３＇－ＲＡＣＥＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?．一一＿馨、暴豪：端＇瀘??１０００?＂?；?％§ｆ?＾?ｌｌ???＿＿?ＯｆＳｅｒｐｉＢｌ??５００?變靡？蕾心實(shí)??２５０??售??１００?■?Ｅ，?＇贏爲(wèi)＿蠢ｆ廠甚??圖１．４亞洲玉米螟幼蟲＆ｒ；？／？２基因的Ｔ－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物菌落ＰＣＲ鑒定??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＮＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－５，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??

１識(shí)三，：：心．「一??圖１．６亞洲玉米螟幼蟲＆ｒ／？＞７２基因的３＇－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物菌落ＰＣＲ鑒定??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＭＡ?（ＤＬ２０００）?；?１－８，?３＇－ＲＡＣＥ菌落ＰＣＲ產(chǎn)物的電泳結(jié)果??Ｉ?—??圖１．７亞洲玉米螟幼蟲基因的第一次ｙ－ＲＡＣＥ擴(kuò)增產(chǎn)物??注：Ｍ，標(biāo)準(zhǔn)分子量ＤＮＡ?（ＤＬ５０００）?；?１－５，５１ＡＣＥＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周淑香;魯新;李麗娟;張國(guó)紅;丁巖;劉宏偉;;不同化性亞洲玉米螟單倍型分析[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2012年04期

2 張玉江,丁永樓;亞洲玉米螟為害水稻初步觀察[J];中國(guó)稻米;1995年03期

3 慕立義;王開運(yùn);;亞洲玉米螟對(duì)六六六抗藥性及取代藥劑的研究[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);1987年03期

4 卿九齡,陳昌蘭,王克鈺,黃仁軍;萬縣地區(qū)亞洲玉米螟的鑒定[J];四川農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);1988年02期

5 汪羞德;;亞洲玉米螟對(duì)甜玉米產(chǎn)量損失的影響[J];上海農(nóng)業(yè)科技;1988年03期

6 慕立義;王開運(yùn);;殺蟲劑室內(nèi)選育亞洲玉米螟抗藥性及交互抗性的研究[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);1988年03期

7 忻亦芬;劉志嫻;馬紹元;徐文貴;;飛機(jī)噴灑Bt及Bt混劑防治亞洲玉米螟試驗(yàn)[J];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1989年01期

8 翟保平;陳瑞鹿;;亞洲玉米螟飛翔能力的初步研究[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);1989年01期

9 孟昭金;高靜;陳平;王慶軍;高姝;;亞洲玉米螟預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)方法及綜合防治[J];河北農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年05期

10 楊益眾，戴志一，黃東林，王春安，高泰東，王生元，張銀貴，高聯(lián)義;棉田亞洲玉米螟生物學(xué)的研究[J];華東昆蟲學(xué)報(bào);1996年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 涂小云;亞洲玉米螟滯育和生物學(xué)特性地理變異的研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 張柱亭;亞洲玉米螟對(duì)氣候變暖的響應(yīng)及其對(duì)溫度脅迫的適應(yīng)機(jī)制研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 白樹雄;轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米次生代謝物質(zhì)的變化及對(duì)亞洲玉米螟寄生性天敵腰帶長(zhǎng)體繭蜂的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

4 胡建;腰帶長(zhǎng)體繭蜂抵御其寄主亞洲玉米螟細(xì)胞免疫反應(yīng)的機(jī)理研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

5 屈明博;亞洲玉米螟幾丁質(zhì)合酶基因表達(dá)與生理功能研究[D];大連理工大學(xué);2012年

6 郭井菲;亞洲玉米螟取食玉米產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

7 黃麗莉;亞洲玉米螟不同地理種群雜交后代滯育特性與mtDNACOⅠ序列特性的研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 王增霞;Cry1Ac蛋白對(duì)腰帶長(zhǎng)體繭蜂的安全性評(píng)價(jià)及兩者對(duì)亞洲玉米螟生理機(jī)制的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙雅;Serpin2和βGRP3在亞洲玉米螟免疫識(shí)別和防衛(wèi)過程中的功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

2 劉雪微;亞洲玉米螟Bt抗性種群的遺傳多樣性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 阿依克孜;新疆荒漠綠洲生態(tài)區(qū)亞洲玉米螟主要生物學(xué)特性及發(fā)生世代驗(yàn)證[D];塔里木大學(xué);2018年

4 付軍;球孢白僵菌（Beauveria bassiana）對(duì)亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）產(chǎn)卵選擇行為的調(diào)控機(jī)制[D];東北師范大學(xué);2018年

5 張文璐;基于碳穩(wěn)定同位素技術(shù)的亞洲玉米螟寄主來源研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

6 韓永旭;高溫對(duì)亞洲玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

7 徐秋雯;亞致死濃度蟲酰肼及Methoprene對(duì)亞洲玉米螟幼蟲多巴脫羧酶基因表達(dá)的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

8 李忠;亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的克隆、表達(dá)分析及RNAi[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

9 吳桃燕;亞洲玉米螟免疫相關(guān)模式識(shí)別受體基因β-1,3-GRP的cDNA克隆及表達(dá)分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

10 孫光芝;第二代赤眼蜂—載菌蜂的研制及其防治玉米螟效果評(píng)價(jià)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

本文編號(hào)：2843801