水稻稻瘟病是最嚴(yán)重的水稻病害之一,稻瘟病是一種由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻病害,嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量,每年可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)約30%。為了減少農(nóng)業(yè)損失,研究水稻與稻瘟病菌之間的相互作用已成為急需解決的問題。因此越來越多的科學(xué)家開始研究水稻與稻瘟病之間相互作用的機(jī)制,稻瘟病已經(jīng)成為研究植物與真菌之間相互作用的一種模式菌種。至今,培育廣譜、持久稻瘟病抗性的水稻品種是防治稻瘟病菌最有效的方法之一。特特普是一種具有持久稻瘟病抗性的高抗水稻品種。首先我們完成了特特普的全基因組測序,預(yù)測出37054個基因,包含455個核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)蛋白的基因(NBS-LRR類型基因,簡稱NLR基因)。我們在特特普品種中利用高通量克隆方法成功克隆了 219個NLR基因,分別轉(zhuǎn)基因至兩個感病品種TP309和Shin2中,并用12個不同的稻瘟病菌株進(jìn)行鑒定。研究表明,其中90個克隆的NLR基因能夠?qū)怪辽?種稻瘟病菌株,并且每一個稻瘟病菌株都能夠被很多個NLR基因識別,然而有很少的NLR基因能夠?qū)?種以及以上的稻瘟病菌株,表明特特普NLR基因表現(xiàn)出比較高的抗性冗余現(xiàn)象,同時特特普廣譜、持久抗性可能需要多個NLR基因共同作用。為了驗(yàn)證NLR基因是否存在互作,本研究從最簡單的兩個基因,即成對NLR基因入手,提出了一種快速鑒定成對NLR抗性基因的方法,其中每個基因都作為獨(dú)立的個體行使不同功能,只有當(dāng)兩個NLR基因同時存在時才能引起植株的免疫反應(yīng)。我們分別在特特普和日本晴、明恢63、R498其他三種基因組中發(fā)現(xiàn)大于20%的NLR基因都是成對基因,在特特普基因組成功鑒定出43對成對NLR基因,在日本晴基因組成功鑒定出47對成對NLR基因。并且選取25對成對NLR基因進(jìn)行基因敲除,成功得到7對成對NLR基因敲除突變體植株,得到與其功能相對應(yīng)的表型。綜上,本研究深入研究了高抗稻瘟病品種Tetep的持久、廣譜抗性的潛在抗性機(jī)制,通過對該抗性基因組進(jìn)行長序列組裝、NLR基因注釋、并對其中大部分NLR基因進(jìn)行克隆和抗性鑒定工作,揭示了其具有高度的抗性冗余與復(fù)雜的抗性互作網(wǎng)絡(luò),同時進(jìn)一步利用敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了成對基因的頻繁互作,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了能夠快速鑒定NLR基因簇和基因?qū)Φ姆肿訕?biāo)記數(shù)據(jù)庫,從而推進(jìn)新的高抗品種育種的進(jìn)程。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.111.41
【部分圖文】：

％］。由于自身免疫引起的遺傳負(fù)荷，使得基因?qū)Φ倪x擇壓受到負(fù)調(diào)控作逡逑用，從而限制了基因?qū)Φ臄U(kuò)張（圖１．６Ａ）。與之相反，撤Ｃ與依賴Ｍ？Ｃ的逡逑基因通過適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制實(shí)現(xiàn)功能，Ｗ此依賴ＮＲＣ的基因通過正調(diào)控而不逡逑是負(fù)調(diào)控作用于貓因，從而激活下游免疫反應(yīng)（閣１．６Ａ）。ＮＲＣ網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)逡逑化模型會產(chǎn)生大量的基因復(fù)制和功能分化，為了維持免疫網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性，ｓｅｎｓｏｒ逡逑Ｍｌｉ？基因產(chǎn)生大量擴(kuò)張，ｈｅｌｐｅｒＴＶＬ／？基因存在少量的擴(kuò)張（圖１．６Ｂ），從而應(yīng)對逡逑快速演化的病原菌＠４］。這種基因網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)象不止存在于ＮＲＣ基因家族中，例如擬逡逑南芥的ＡＤＲ１家族成員（兒Ｄｉ？ｉ，＾４￡？凡？－１２）是ｓｅｎｓｏｒ邋Ｃ／ＶＬ類型基因逡逑（ｉｔｒａ２，似２）和邋７７ＶＬ邋類型基因（ｉｉＰＰ２，５／ＶＣ７，燦幻和邋ＣＨＳ７）介導(dǎo)逡逑免疫反應(yīng)所必需的［１Ｑ６＿１（）９］。另一個擬南芥基因同樣是ｓｅｎｓｏｒ邋７７ＶＬ類型基因逡逑｛Ｒｏｑｌ

ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ邋融合序列，稱為指導(dǎo)邋ＲＮＡ邋（ｇｕｉｄｅ邋ＲＮＡｓ，ｇＲＮＡｓ），由邋Ｕ６邋啟逡逑動ｆ治動的起始為Ｇ，跟隨ＰＡＭ邋（ＮＧＧ）之后長度為２０ｂｐ的ｃｒＲＮＡ指導(dǎo)Ｃａｓ９逡逑蛋白對基因組進(jìn)行剪切過程（圖１．７）邋［１３７］。逡逑到目前為止，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)己經(jīng)廣泛于細(xì)菌，真菌以及動植物的基因編逡逑輯過程。在植物中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)已經(jīng)成功運(yùn)用到擬南芥，水稻，煙草和高逡逑粱上［１３８＿１４３］，最早關(guān)于ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系統(tǒng)的研宄表明成功將靶位點(diǎn)插入堿基，以逡逑不同的效率敲除靶基因的功能。進(jìn)一步的研宄表明敲除成功的擬南芥和水稻基因逡逑能夠穩(wěn)定遺傳給下一代［１４４，１４５］。為了同時敲除多個基因，將不同基因的ｇＲＮＡ構(gòu)逡逑建到同一質(zhì)粒，然后指導(dǎo)Ｃａｓ９蛋白錨定到不同基因位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因的功能敲除逡逑１４９逡逑0逡逑２０逡逑

邋ｖ２．３邋？０邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｎａｌｖｔｉｃａｌ－逡逑ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｍｔｔ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）進(jìn)行處理得到ｓｕｂｒｅａｄｓ邋（圖２．３）。通過篩選除掉長度低于逡逑５００ｂｐ邋或者是讀長小于邋０．８邋的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ，剩下的邋Ｓｕｂｒｅａｄｓ邋利用邋Ｃａｎｕ邋ａｓｓｅｍｂｌｅｒ邋ｖｌ．４逡逑（參數(shù)設(shè)置“ｇｅｎｏｍｅＳｉｚｅ＝４４９ｍｏｖｓＭｅｍｏｒｙ＝４０ｇ－１００ｇ”，其余為默認(rèn)參數(shù)）進(jìn)行基逡逑因組草圖的組裝［１４９］。組裝得到的ｃｏｎｔｉｇｓ經(jīng)過ＳＭＲＴ分析軟件當(dāng)中的Ｑｕｉｖｅｒ工逡逑２７逡逑

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