發(fā)布時(shí)間：2020-09-22 16:04

　　 miR319是一種保守的miRNA,已有研究發(fā)現(xiàn)它參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)干旱、寒冷及鹽脅迫的應(yīng)答,但在真菌脅迫應(yīng)答方面的研究幾乎沒(méi)有。本實(shí)驗(yàn)旨在利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究植物miR319c及其靶基因在灰霉菌侵染植物過(guò)程中的生物學(xué)功能。得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下:(1)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR319c在感染灰霉菌的番茄中表達(dá)下調(diào),靶基因TCP24和TCP29的表達(dá)上調(diào),說(shuō)明miR319c可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因參與番茄葉片對(duì)灰霉菌感染的響應(yīng)。(2)在轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因番茄中,miR319c得到了過(guò)量表達(dá),相應(yīng)地,其5個(gè)TCP家族成員的靶基因表達(dá)顯著下降。(3)接菌實(shí)驗(yàn)證實(shí),過(guò)表達(dá)miR319c的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片和轉(zhuǎn)基因番茄葉片沒(méi)有明顯的病斑,臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)灰霉菌菌絲在過(guò)表達(dá)miR319c的植株相比于各自的野生型明顯受到抑制,說(shuō)明miR319c的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)灰霉菌的抗性。(4)基于過(guò)表達(dá)miR319c轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)的抗性,本研究對(duì)茉莉酸(JA)合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、miRNA合成過(guò)程關(guān)鍵基因以及一些脅迫應(yīng)答相關(guān)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了RT-qPCR檢測(cè)。其中,JA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)大多數(shù)都呈上調(diào),可能JA響應(yīng)灰霉菌的誘導(dǎo)從而激活下游相關(guān)防御反應(yīng);另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示植物響應(yīng)脅迫相關(guān)miRNAs的表達(dá)受miR319c過(guò)表達(dá)的影響;miR319c的過(guò)表達(dá)或者灰霉菌的侵染對(duì)miRNA合成途徑主要基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響。(5)基于RNAi技術(shù)和過(guò)表達(dá)手段,構(gòu)建了miR319靶基因TCP的RNAi載體和過(guò)表達(dá)載體,并導(dǎo)入擬南芥。總之,本實(shí)驗(yàn)成功獲得了ath-miR319c過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥和番茄植株,揭示了miR319c的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)灰霉菌的抗性。
【學(xué)位單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S436.412
【部分圖文】：

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 番茄miR319c對(duì)灰霉病菌侵染的應(yīng)答及其功能研究的CT值-內(nèi)參的CT 值）灰霉菌處理組（-所需檢測(cè)基因的 CT 值-內(nèi)參的 CT 值）對(duì)照組[66]。2.8 MiR319 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生2.8.1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建為了進(jìn)一步研究 miR319c 在植物適應(yīng)非生物脅迫或生物脅迫中發(fā)揮作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 miR319c 過(guò)表達(dá)載體，含有 miR319c 前體（pre-athmiR319c）的擬南芥互補(bǔ) DNA（cDNA）被擴(kuò)增，然后克隆到表達(dá)載體 pBIN438，產(chǎn)生ath-miR319c 過(guò)表達(dá)基因構(gòu)建體，p35S-athmiR319c / p35S-Km。如圖 1 所示，ath-premiR319c 基因處于 CaMV 35S 啟動(dòng)子下游。

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 灰霉菌侵染后番茄葉片的分子檢測(cè)1.1 MIR319c 在灰霉菌侵染的番茄葉片表達(dá)變化先前的研究表明 miR319 與一些非生物脅迫（干旱、鹽、寒冷、氮缺乏）有關(guān)，此外，本實(shí)驗(yàn)室之前在感染灰霉菌 7d 的番茄（金棚 1 號(hào)）葉片中進(jìn)行高通量分析，研究響應(yīng)灰霉菌脅迫的 sRNA，結(jié)果顯示 miR319 由灰霉菌感染誘導(dǎo)[54]。為了研究灰霉菌侵染番茄后 miR319c 的響應(yīng)模式和作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在感染了灰霉菌的番茄（microTom）葉片內(nèi)檢測(cè) miR319c 的表達(dá)水平和表達(dá)動(dòng)態(tài)（microTom 是模式植物，生長(zhǎng)周期短，個(gè)體小，做轉(zhuǎn)基因相對(duì)容易）。RT-qPCR結(jié)果表示，在感染了灰霉菌的番茄葉片內(nèi)，隨著侵染時(shí)間的推移，miR319c 的表達(dá)也在發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)趨勢(shì)顯示上調(diào)；前體的表達(dá)趨勢(shì)顯示下調(diào)，miR319c 表達(dá)下調(diào)。

圖 3 miR319c 在番茄中的靶基因 TCP24 和 TCP29 在感染灰霉菌的番茄葉片內(nèi)的動(dòng)2 過(guò)表達(dá) MiR319c 轉(zhuǎn)基因擬南芥分子分析2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽(yáng)性鑒定2.1.1 Kan 基因的擴(kuò)增為了篩選含有 miR319c 過(guò)表達(dá)構(gòu)建體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物，本實(shí)驗(yàn)以和轉(zhuǎn)基因型的擬南芥基因組為 PCR 模板，擴(kuò)增 Kan 基因并鑒定出 13 個(gè)陽(yáng)因株系。如圖所示，13 個(gè) line 的基因組中均擴(kuò)增出了 Kan 基因，說(shuō)明過(guò)體已經(jīng)在擬南芥中成功表達(dá)。圖 4 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片內(nèi) Kan 基因的擴(kuò)增

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