花生(Arachis hypogaea L.)是世界范圍內(nèi)重要的植物油脂和蛋白質(zhì)來源,近三十年來中國花生總產(chǎn)量和消費量穩(wěn)居世界首位,在保障國家食物安全中作用不可替代。然而,黃曲霉毒素污染是影響花生食品安全和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素,提高花生品種抗性是降低黃曲霉毒素污染風(fēng)險的迫切需要�；ㄉv殼是抵御黃曲霉菌侵染的第一道防線,但國內(nèi)外尚未有效開展花生莢殼對黃曲霉菌侵染抗性的研究,限制了這一抗性的改良與應(yīng)用。本研究通過對不同花生品種在實驗室條件下接種黃曲霉菌,首次建立了花生莢殼對黃曲霉菌侵染抗性的鑒定方法,進而對中國、國際半干旱研究所(ICRISAT)和美國花生微核心種質(zhì)進行了莢殼抗性的鑒定,發(fā)掘出了抗性種質(zhì)。同時,利用新開發(fā)的SSR和SNP分子標記對中國花生微微核心種質(zhì)進行了莢殼抗性的關(guān)聯(lián)分析,獲得了與抗性顯著關(guān)聯(lián)的位點。1.通過花生莢果接種對比試驗觀察,首次將花生莢果(殼)受黃曲霉菌侵染程度劃分為1~9級,并確立了莢果感染指數(shù)的計算方法。選取代表性花生品種J11、徐花13、中花6號和中花12進行實驗室接種黃曲霉菌,比較品種間病情動態(tài)變化及差異,經(jīng)綜合分析確立了莢殼抗性鑒定的最合適接種濃度為2×10~6孢子/mL、最合適培養(yǎng)時間為7天。經(jīng)遺傳多樣性豐富的花生材料接種驗證,該方法可有效區(qū)分不同花生品種的抗性差異,為花生莢殼黃曲霉侵染抗性研究提供了技術(shù)手段。2.利用所建立的莢殼抗性鑒定方法,對99份中國花生微微核心種質(zhì)進行了三輪抗性鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果的比較分析,發(fā)現(xiàn)Zh.h1837、Zh.h2339、Zh.h2359、Zh.h4712和Zh.h6180等5份種質(zhì)材料的莢殼抗性相對較強,而且穩(wěn)定。以相同方法對ICRISAT和美國花生微核心種質(zhì)進行接種鑒定,發(fā)現(xiàn)8份穩(wěn)定表現(xiàn)為中抗以上的材料,分別為PI196635、PI494034、PI476432、PI494034、PI337406、PI268586、PI259851和PI296550。本研究是國際上對花生這一特殊性狀的首次系統(tǒng)評價,所發(fā)掘出的13份穩(wěn)定抗性種質(zhì)為花生黃曲霉抗性遺傳改良和莢殼抗性機理研究提供了特異材料。3.通過群體結(jié)構(gòu)分析,利用SNP數(shù)據(jù)將群體分為2個亞群,并通過UPGMA進化樹和主成分(PCA)分析得到驗證。在此基礎(chǔ)上,利用37152個SNP標記與抗性進行關(guān)聯(lián)分析,檢測到9個與莢殼抗性顯著相關(guān)的SNP位點,表型變異解釋率為8.60%~31.95%,其中7個位點位于A03染色體上,在染色體片段上分布較為集中,表明該片段對莢殼抗性的表型分化具有顯著影響。此外,A04和B02染色體上各檢測到1個與抗性顯著關(guān)聯(lián)的位點,表型變異解釋率分別為23.71%和22.51%。此外,通過554個SSR標記與3個環(huán)境下抗性鑒定數(shù)據(jù)的平均值進行關(guān)聯(lián)分析,共檢測到3個與莢殼抗性顯著關(guān)聯(lián)的標記位點,其中SSR標記AGGS1483和Ai124P23標記位點表型變異解釋率較高,分別為6.54%和6.82%,且都位于A03染色體上。SNP和SSR關(guān)聯(lián)位點的發(fā)現(xiàn)對于花生莢殼黃曲霉菌侵染抗性的分子標記輔助育種具有重要應(yīng)用價值。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.652
【部分圖文】：

發(fā)現(xiàn)不同花生材料感染黃曲霉菌的差異較大。有的材料能觀察到的莢殼表面感染真菌孢子只產(chǎn)生于莢殼的局部位置；有的材料雖然表面感染較多，但真菌孢子的覆蓋；有的材料則不僅莢殼表面均長滿黃曲霉菌孢子，而且孢子堆的覆蓋度很厚實。這些然條件下花生受黃曲霉菌的感染差異相近，而且也與花生仁人工接種黃曲霉菌后的感。為了區(qū)分不同花生品種莢殼受黃曲霉菌感染的相對差異，根據(jù)觀察到的上述情況并侵染抗性的鑒定方法，將莢殼受感染程度劃分為 1-9 級（表 2.1，圖 2.1）。其中，表 2面孢子覆蓋率是指莢殼表面均勻附著黃曲霉孢子的面積與莢殼表面積之比；莢殼厚孢指莢殼表面斑狀、深綠色黃曲霉孢子群所覆蓋面積與莢殼表面的比值。表 2.1 花生莢殼受黃曲霉菌感染的 1-9 級Table 2.1 A 1-9 scale of infection by Aspergillus flavus on peanut shells感染等級 1 2 3 4 5 6 7 8 9莢殼表面孢子覆蓋率（%）0 0-20 20-40 40-60 60-80 80-100 100 100 10莢殼表面厚孢子覆蓋率（%）0 0 0 -5 5-10 10-30 30-50 50-70 70-90 90-1

圖 2.3 不同接種方案感染指數(shù)均值的品種間差異Fig. 2.3 Varietal differences of mean infection index under different inoculation treatments注：相同小寫字母表示 P＜0.05 水平下，兩個處理間平均數(shù)差異不顯著(Tukey)。Note: The same letters indicates no significant difference at 0.05 level by Tukey method．2.3 花生莢殼抗黃曲霉菌侵染鑒定方法的驗證利用所建立的花生莢殼侵染抗性鑒定方法，對全球三大代表性花生核心種質(zhì)共 276 份材料16 年在武漢種植，收獲后進行了莢殼抗性的初步鑒定評價。人工接種試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同花質(zhì)莢殼（莢果）對黃曲霉菌侵染的抗性存在明顯差異（圖 2.4）。根據(jù) 3 次重復(fù)接種試驗結(jié)果均值，276 份花生種質(zhì)的感染指數(shù)分布情況為：感染指數(shù) 0.21-0.30 有 2 份，0.31-0.40 有 541-0.50 有 16 份，0.51-0.60 有 52 份，0.61-0.70 有 94 份，0.71-0.80 有 65 份，0.81-0.90 有 29 份91-1.00 有 13 份。從總體上看，276 份花生材料的感染指數(shù)呈正態(tài)分布（圖 2.5），這與花生種黃曲霉侵染或產(chǎn)毒的抗性以及花生對葉斑病、青枯病等抗性的種質(zhì)間差異分布相似，也符合多基因控制的數(shù)量性狀的分布特點。這一初步試驗結(jié)果也表明，利用本研究所建立的接種和方法能區(qū)分花生種質(zhì)資源莢殼抗性的差異，證明該方法具有可行性、有效性和實用性。

圖 2.4 不同花生種質(zhì)莢殼受黃曲霉菌侵染的差異Fig. 3.1 Reaction of different peanut accessions to A.flavus infection in shell圖 2.5 276 份花生種質(zhì)材料的感染指數(shù)分布01020304050607080901000.21-0.30 0.31-0.40 0.41-0.50 0.51-0.60 0.61-0.70 0.71-0.80 0.81-0.90 0.91-1.00

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