小麥藍(lán)矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)是發(fā)生在我國(guó)西北地區(qū)冬小麥上的植原體病害。早在上世紀(jì)50年代,該病害首次在陜西報(bào)道,之后擴(kuò)展到甘肅,寧夏和山西等地。小麥藍(lán)矮病是由小麥藍(lán)矮植原體侵染引起的病害,由介體昆蟲異沙葉蟬(Psammotettix alienus L.)傳播,近些年由于麥草覆蓋技術(shù)的推廣,使得介體昆蟲越冬基數(shù)增加,該病害逐漸擴(kuò)展到黃河中下游干旱區(qū),給小麥生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。本實(shí)驗(yàn)室采用Solexa DNA測(cè)序方法完成了小麥藍(lán)矮植原體的基因組圖譜,對(duì)預(yù)測(cè)的37個(gè)分泌蛋白進(jìn)行了抑制子的篩選和致病性分析,篩選到SWP6蛋白可以抑制BAX引起的本氏煙細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)。然而,SWP6蛋白的功能及作用機(jī)理尚未明確,本論文針對(duì)小麥藍(lán)矮植原體SWP6蛋白開展了關(guān)鍵功能域鑒定,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及亞細(xì)胞定位等一系列試驗(yàn),旨在能夠明確SWP6蛋白的功能,取得以下試驗(yàn)結(jié)果:1.對(duì)SWP6蛋白的同源性、理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)。明確了SWP6基因全長(zhǎng)618 bp,編碼206個(gè)氨基酸,編碼蛋白分子量大小約為23.8 kDa,等電點(diǎn)pI為6.98,多肽原子組成為C_(1063)H_(1721)N_(269)O_(315)S_(11),疏水性系數(shù)為0.120,屬于疏水性蛋白。其信號(hào)肽切割位點(diǎn)在蛋白N端第30-31個(gè)氨基酸,分泌到胞外成熟的分泌蛋白有174個(gè)氨基酸,分子量大小約為19.6 kDa。SWP6蛋白包含所有常見的20種氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,比例為13.6%。在第10-30個(gè)氨基酸之間存在跨膜區(qū)域,二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)SWP6蛋白有3個(gè)α螺旋和多個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。2.以SWP6的生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)為基礎(chǔ),構(gòu)建了SWP6的5個(gè)功能域缺失突變體。分別命名為pGR107-SWP6DH1、pGR107-SWP6DH2、pGR107-SWP6DH3、pGR107-SWP6DH4、pGR107S-WP6DH5。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因在本氏煙中的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),在本氏煙中分別瞬時(shí)表達(dá)5個(gè)缺失突變體,通過(guò)觀察本氏煙葉片癥狀和對(duì)接種葉RT-PCR的檢測(cè),明確了SWP6蛋白中第84-113個(gè)氨基酸對(duì)其行使功能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。以pCAMBIA1302為骨架載體構(gòu)建了SWP6和eGFP融合的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)SWP6和eGFP的融合蛋白,確定了SWP6定位在本氏煙細(xì)胞膜中。3.通過(guò)對(duì)SWP6瞬時(shí)表達(dá)的本氏煙轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的初步分析,篩選到差異表達(dá)基因有1093個(gè),其中,上調(diào)表達(dá)基因540個(gè),下調(diào)表達(dá)基因553個(gè)。挑選4個(gè)上調(diào)和4個(gè)下調(diào)關(guān)鍵基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明這些基因差異表達(dá)倍數(shù)均與測(cè)序結(jié)果相吻合,為后續(xù)SWP6功能的進(jìn)一步驗(yàn)證提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.12
【部分圖文】：

圖 1-1 健康長(zhǎng)春花和 WBD 植原體感染長(zhǎng)春花Fig.1-1 The heathy Periwinkle and wheat blue dwarf phytoplasma disease in Periwinkle2 小麥藍(lán)矮植原體病原學(xué)特征與傳播介體早年，小麥藍(lán)矮病經(jīng)常發(fā)生在寒冷天氣條件下的霜凍或施氮肥較多的土壤麥田。染病害后的顯癥時(shí)間會(huì)比較快，所以人們認(rèn)為小麥藍(lán)矮病是與天氣有關(guān)的生理病三等（1984）報(bào)道了小麥藍(lán)矮病害的發(fā)生、表現(xiàn)癥狀與傳播媒介，發(fā)現(xiàn)異沙葉蟬藍(lán)矮病專性傳播介體昆蟲，并且初步研究了異沙葉蟬的生物學(xué)傳毒特性，但此時(shí)小麥藍(lán)矮病是病毒引起的。安德榮等（1991）通過(guò)對(duì)小麥藍(lán)矮病組織學(xué)分析和電，并且用四環(huán)素等抗生素對(duì)發(fā)病小麥進(jìn)行處理，結(jié)果表明小麥被四環(huán)素處理對(duì)其有明顯抑制作用，綜合分析說(shuō)明類菌原體是小麥藍(lán)矮病發(fā)病的病原物。張秦風(fēng)93）根據(jù)病原菌，寄主和介體及四環(huán)素對(duì)病株的敏感性，確定了小麥藍(lán)矮病屬于病害，這也是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的首例小麥植原體病害。顧沛雯等（2005）采用巢式 PC帶病小麥 DNA，從分子水平證明藍(lán)矮病是植原體病害。3 小麥藍(lán)矮植原體寄主范圍與發(fā)生規(guī)律張秦風(fēng)等（1992）和相建業(yè)等（1994）在陜西省楊凌區(qū)、渭南市、寶雞市等地調(diào)

2.1 試驗(yàn)方法2.1.1 SWP6 氨基酸序列同源性分析在生物信息中心 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載 SWP6 基因編碼的氨基酸序列，利用 NCBI 的在線工具 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性的比對(duì)分析。2.1.2 SWP6 蛋白理化特性的分析利用 Expasy 網(wǎng)站在線提供的軟件（http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam）進(jìn)行蛋白基本特性的分析；利用 PSIPRED 軟件（http://brylinski.cct.lsu.edu/content/psipred）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用 swiss-model 軟件（http://swiss-model.expasy.org/）進(jìn)行同源建模的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析；利用 signalP 軟件對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；利用在線軟件 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；利用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親水性預(yù)測(cè)。2.1.3 SWP6 基因及其氨基酸序列

圖 2-2 SWP6 蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)（Hidden Markov models）Fig.2-2 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Hidden Markov models）圖 2-3 SWP6 蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)（Neural networks）Fig.2-3 Prediction of the signal cleavage site of effector SWP6（Neural networks）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821387