【摘要】：棉花是世界上重要的經(jīng)濟作物,黃萎病嚴重危害棉花產(chǎn)量和纖維品質,尋找抗黃萎病基因,明確基因功能,深入解析棉花抗黃萎病的分子機制是棉花抗病育種中亟需解決的重要科學問題。高質量版本的基因組是提升基因家族分析準確性的必要條件。本研究以目前最新的陸地棉TM-1高質量版本基因組為參考,通過生物信息學分析鑒定了陸地棉基因組中的Laccase(LAC)基因家族,并對其進行了理化性質、基因結構、染色體定位以及在黃萎病脅迫下的表達模式分析。結合抗病轉錄組數(shù)據(jù)和全長cDNA文庫篩選以及功能尚未報道的前提,挑選出4個與擬南芥直系同源的新基因,分別命名為GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12。為明確候選基因抗黃萎病功能及分子機制,本研究進一步從基因表達、VIGS基因功能方面研究了四個候選基因的功能。主要研究結果如下:1.陸地棉TM-1基因組鑒定到83個LAC家族成員,分布在24條染色體上,所有LAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示LAC基因家族成員可分為7個亞組。生物信息學分析GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12分別編碼558、564、563、510個氨基酸殘基蛋白,GhLAC4,GhLAC7和GhLAC11分別含有一個信號肽,GhLAC12沒有信號肽,GhLAC11具有一個跨膜域,其他三個基因無跨膜域。亞細胞定位結果顯示,四個漆酶基因編碼蛋白都定位在細胞外。2.基于黃萎病脅迫下抗病陸地棉農大601的轉錄組數(shù)據(jù),將LAC基因家族各成員的表達分為3種模式,第1類基因呈現(xiàn)出病原菌誘導后表達上調,包括GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43等24個成員;第2類基因受病原菌脅迫后呈現(xiàn)不同程度下調表達,包括GhLAC07、GhLAC40、GhLAC45、GhLAC72等56個成員,接菌后這些基因的表達明顯受到抑制,暗示這些基因在棉花抗黃萎病反應中起負調控作用;第3類基因不響應黃萎病菌處理,推測其不參與棉花抗黃萎病過程,包括GhLAC11、GhLAC27和GhLAC49。3.進一步利用實時熒光定量PCR鑒定了4個漆酶基因受黃萎病菌誘導后的表達,發(fā)現(xiàn)GhLAC4,GhLAC11和GhLAC12受黃萎病菌誘導表達上調,與轉錄組表達趨勢一致,GhLAC7受黃萎病菌抑制表達。組織特異表達結果顯示4個基因在根、莖、葉中均表達;GhLAC4在莖中表達量最高,在根中表達量次之;GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12在根中表達量最高,莖中次之,葉中表達量均最低。4.啟動子元件分析表明GhLAC4基因含有響應茉莉酸甲酯(JA)和水楊酸(SA)的順式作用元件,GhLAC11含有響應SA的順式作用元件;棉苗葉面噴施SA或JA,基因表達結果表明GhLAC4響應SA和JA信號;GhLAC11僅響應SA信號誘導。5.從抗病農大601中克隆GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12目的片段,長度為340 bp左右,構建VIGS載體。接黃萎病菌25d后,四個基因的沉默棉株病指低于對照,抗病性增強,沉默棉株的H_2O_(2,)SOD和NO含量高于對照;沉默棉株的POD活力低于對照。6.接菌25d的沉默棉株和對照棉株的木質素原位染色與測定結果顯示,沉默棉株木質素染色均變淺,說明漆酶基因沉默后木質素積累降低;溴乙酰法進一步測定木質素含量表明,沉默棉株GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12木質素百分含量分別為15.34%、7.58%、14.78%、23.22%,對照棉株木質素百分含量為33.31%。7.利用qRT-PCR分析沉默植株苯丙烷途徑木質素合成途徑及其旁支黃酮類化合物和棉酚合成路徑基因的轉錄變化,發(fā)現(xiàn)沉默植株木質素合成途徑基因PAL,4CL,COMT,HCT,CCoAOMT和CAD的表達水平均高于對照,表明較低的木質素含量對木質素途徑合成酶基因的轉錄水平呈負反饋;黃酮類化合物和棉酚合成相關基因CHS,CHI,DFR,F3H,F3'H,LAR,ANR和TBS表達水平高于對照。綜上,本研究鑒定了陸地棉83個GhLAC成員,明確了黃萎病菌誘導下各成員的表達規(guī)律;明確了GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12四個基因的功能;初步探明了四個成員的抗黃萎病機制。
【學位授予單位】：河北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.621.2
【圖文】：

棉和擬南芥 LACs 基因家族進化樹分析Fig.2 Phylogenic tree of LACs family members in Arabidopsis and G. hirsutum L..1.3 陸地棉漆酶基因家族的結構和保守基序分析對陸地棉 LAC 基因家族 83 個成員的基因結構和保守基序進行分析，結果如圖示，所有 LAC 基因的外顯子個數(shù)在 4-7 個之間變化，且基本都含有相同的保守 (Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif4, Motif5, Motif 9 和 Motif 10; 圖 4)。經(jīng) Pfam 數(shù)驗證，Motif 1 和 Motif 9 完全對應于 Cu_oxidase_3 結構域；Motif 3 與 Cu-oxid構域相對應；Motif2 和 Motif4 則構成了 Cu_oxidase_2 結構域。某些保守基序只于某一亞組中，如 Motif 8 只存在于第 7 亞組中，這表明不同組的漆酶成員在進功能上存在差異。

27圖 3 陸地棉 LAC 家族成員基因結構分析Fig.3 Gene structure analysis of LAC family members in G. hirsutum L.

圖 4 陸地棉 LAC 基因家族保守基序Fig.4 Conservative motifs of LAC gene family in G. hirsutum L.棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達分析題組前期以抗病品種農大 601 為實驗材料，獲得了黃萎病脅迫下根的不同處理時間點下的 RPKM 值進行 log2(1+RPKM) 處理后，構建 L的表達熱圖。結果顯示，在 83 個陸地棉 LAC 基因中，有 80 個基因病脅迫下都發(fā)生了明顯的變化，其余 3 個基因(GhLAC11、GhL9)在接菌前后表達量未發(fā)生明顯變化，推測它們不參與棉花抵抗黃萎基因家族各成員的表達分為 3 種模式，第 1 類基因呈現(xiàn)出病原菌誘導括 GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43 等 24 個成員。根據(jù)該類基因對應速度和程度，進步劃分為 3 個亞組：快速上調表達基因（I）9、GhLAC80、GhLAC06、GhLAC02、GhLAC30，這些成員在接菌后 高峰；較快上調表達基因（II），包括 GhLAC20、GhLAC77、GhLAC，該亞組基因在接菌后 6 h 達到表達高峰；第 III 亞組包括 GhL8、GhLAC58 等 10 個成員，受黃萎病菌誘導后這些基因在 12~24 h 之。第 2 類基因受病原菌脅迫后呈現(xiàn)不同程度下調表達，包括 GhL

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本文編號：2806736