【摘要】：小麥條銹病是由專性寄生真菌——條形柄銹菌小麥�；�(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一種嚴(yán)重危害小麥生產(chǎn)的流行性真菌病害,對全球小麥生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為實(shí)現(xiàn)小麥條銹病的持久防控,尋找新的能有效激發(fā)小麥防衛(wèi)反應(yīng)的基因資源是主要措施之一。此前多項(xiàng)研究報道類枯草桿菌蛋白酶(subtilases,SBTs)可以在植物—病原互作過程中誘導(dǎo)寄主的過敏性壞死反應(yīng)(HR)和系統(tǒng)獲得抗性(SAR),在植物抗病反應(yīng)中起到重要作用。然而,關(guān)于植物類枯草桿菌蛋白酶家族基因在與活體營養(yǎng)專性寄生真菌互作的報道較少,尤其是小麥-條銹菌互作方面。本試驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)一個小麥類枯草桿菌蛋白酶TaSBT1可能參與小麥-Pst非親和互作,但編碼該蛋白的基因特性及其具體的功能和作用方式尚不清楚。本研究主要利用生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位技術(shù)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默、qRT-PCR等方法對編碼該蛋白的基因TaSBT1的基本特性和功能進(jìn)行了研究。研究結(jié)果為豐富小麥信號傳遞途徑,揭示小麥抗條銹病分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、TaSBT1基因的基本特性:TaSBT1在小麥基因組中具有三個同源序列TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d,分別位于小麥4A、4B、4D染色體上,TaSBT1a開放閱讀框長2,304 bp,編碼767個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.47 kD,理論等電點(diǎn)為5.79;TaSBT1b的ORF長2,310 bp,編碼769個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.61 kD,理論等電點(diǎn)為5.99;TaSBT1d的ORF長2,295 bp,編碼764個氨基酸,其編碼蛋白分子量為78.25 kD,理論等電點(diǎn)為5.71。TaSBT1編碼蛋白由信號肽、原結(jié)構(gòu)域、類枯草桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)域、蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,與許多植物的類枯草桿菌蛋白酶親緣關(guān)系較近,與山羊草同源序列相似性高達(dá)99%。預(yù)測發(fā)現(xiàn)三個TaSBT1同源蛋白均具有N端信號肽,并且利用酵母信號肽篩選系統(tǒng)成功驗(yàn)證了其編碼蛋白信號肽的分泌功能,亞細(xì)胞定位結(jié)果也同時證明了TaSBT1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)。2、TaSBT1基因功能:通過qRT-PCR技術(shù)分析TaSBT1基因在小麥與條銹菌的互作中的表達(dá)特征,結(jié)果顯示TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d均在非親和互作中的12—24 h之間有強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá),其中TaSBT1b在接種后12 h表達(dá)量最高為對照的7.2倍,TaSBT1a、TaSBT1d分別為對照的4.3倍、6.2倍;三者在接種后24 h也顯著高于對照,為未接種對照的2.5倍;而在親和互作中表達(dá)量無顯著變化。由此推測TaSBT1基因可能參與小麥對條銹菌的防御機(jī)制。采用農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)技術(shù)在煙草葉片中超量表達(dá)TaSBT1基因可以誘發(fā)植物細(xì)胞死亡,表明TaSBT1蛋白參與植物抗病反應(yīng)中的PCD反應(yīng)。進(jìn)一步利用BSMV介導(dǎo)的基因沉默技術(shù),選取目的基因的2個特異片段對小麥中的TaSBT1基因進(jìn)行沉默,接種條銹菌非親和小種CYR20的對照小麥葉片觀察到明顯的過敏性壞死,但沉默植株產(chǎn)生大量的夏孢子堆;接種親和小種CYR33的小麥葉片觀察到目的基因沉默植株與對照相比產(chǎn)孢量無明顯變化,均產(chǎn)生大量夏孢子堆,并且通過臺盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)后期沉默植株壞死面積相比對照植株減少。qRT-PCR分析證明沉默植株在接種CYR20和CYR33后,TaSBT1基因表達(dá)量均有不同程度下降。進(jìn)一步說明TaSBT1基因沉默植株對CYR20的抗性顯著下降。3、TaSBT1基因可能參與的抗病信號途徑:通過外源激素SA、MeJA、ETH處理發(fā)現(xiàn)TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d基因均在SA處理0.5 h后被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),而在MeJA和ETH誘導(dǎo)后無顯著變化,由此推測TaSBT1基因可能參與水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。另外,利用TaSBT1的同源蛋白AtSBT1.7蛋白進(jìn)行STRING預(yù)測,發(fā)現(xiàn)互作可能性較高的蛋白有果膠甲酯酶抑制劑PMEI(AT2G47670)、白細(xì)胞介素-I-受體家族蛋白酶(AT2G17055)、類受體激酶BAM1(MPA24.5)、粘液質(zhì)修飾蛋白(MUM2)和AAA型ATP酶家族蛋白(AT3G24530)。通過測定PME活性驗(yàn)證TaSBT1和PMEI的作用,發(fā)現(xiàn)TaSBT1基因沉默葉片的粗蛋白酶液與對照植株相比在釕紅染色的瓊脂糖凝膠培養(yǎng)基上顯現(xiàn)更淺的顏色,暗示其PME活性提高。由此說明TaSBT1可以通過調(diào)節(jié)植物PME活性來影響植物抗病性,且TaSBT1基因沉默植株的PME活性降低,暗示TaSBT1基因可以提高植株P(guān)ME活性。綜上所述,TaSBT1基因編碼類枯草桿菌蛋白酶,該基因參與小麥與條銹菌非親和互作過程,并調(diào)控小麥對條銹菌的抗病性。本研究為深入了解類枯草桿菌蛋白酶參與調(diào)控小麥對條銹菌免疫應(yīng)答的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ),對持續(xù)全面防治小麥條銹病具有重要的理論意義。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.121.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2788746