【摘要】：薺菜(Capsella bursa-pastoris(L.)Medik.)是我國小麥田主要闊葉雜草之一,廣泛分布于西南地區(qū)、華東地區(qū)、華北地區(qū)和長江流域。苯磺隆(Tribenuron-methyl)屬乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑,是我國長期用作防除麥田薺菜的主要藥劑。但是由于大量、頻繁使用,其在中國主要小麥產(chǎn)區(qū)對薺菜的防治效果已明顯下降,部分地區(qū)甚至出現(xiàn)了防治失敗的現(xiàn)象,嚴重危害小麥產(chǎn)量。本研究以采自河南省的28個薺菜種群為研究對象,針對麥田薺菜對苯磺隆的抗性,從抗性分布、抗性水平、靶標及非靶標抗性機理、交互抗性及抗性種群適合度代價等多方面研究,以期為科學合理防治麥田抗藥性薺菜種群提供理論指導,從而延緩薺菜抗藥性的發(fā)生,主要研究結(jié)果如下:采用整株劑量反應曲線法測定了28個薺菜種群對苯磺隆的抗性水平,結(jié)果顯示測定的28個種群對苯磺隆均產(chǎn)生了高水平的抗藥性,抗性倍數(shù)(RI)在11.3~595.8之間,其中采自駐馬店市的HN-13種群抗性水平最高。對薺菜ALS保守區(qū)片段序列進行擴增和測序,結(jié)果表明苯磺隆抗性種群中共含有以下7種ALS靶標基因突變類型:Pro-197-His(CCT-CAT),Pro-197-Leu(CCT-CTT),Pro-197-Arg(CCT-CGT),Pro-197-Thr(CCT-ACT),Pro-197-Ser(CCT-TCT),Pro-197-Ala(CCT-GCT)和Trp-574-Leu(TGG-TTG)。連接轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明,薺菜中存在兩條ALS基因,且兩條ALS基因均可以發(fā)生突變,并通過Southern blot試驗進行了驗證。在種群HN-01中,兩條ALS基因197位點同時發(fā)生了突變,其中ALS-1中發(fā)生Pro-197-Ser(CCT-TCT)取代,ALS-2中發(fā)生Pro-197-His(CCT-CAT)取代。以β蛋白基因為內(nèi)參基因,采用實時熒光定量PCR法測定了薺菜抗敏種群中兩條ALS基因在轉(zhuǎn)錄水平的差異;施用苯磺隆前后抗敏種群中ALS基因表達量的變化;薺菜不同器官組織根、莖和葉中ALS基因的表達量差異。結(jié)果表明ALS-1和ALS-2基因在表達量上無明顯差異,抗性種群中ALS基因的表達量明顯高于敏感種群;使用苯磺隆后,抗性種群中ALS基因的表達量出現(xiàn)明顯上升;薺菜葉組織中ALS基因的表達量明顯高于根莖組織。分別以BsiY I和Nco I為內(nèi)切酶設計了dCAPS分子標記,用于檢測薺菜ALS基因197和574位點的野生型薺菜種群,從而鑒定突變型抗性薺菜種群的存在。經(jīng)驗證,dCAPS分析結(jié)果準確可靠,與基因測序結(jié)果相一致。靶標酶ALS離體活性測定結(jié)果表明,抗敏種群中ALS總催化活性基本一致。突變型抗性種群(HN-01,HN-02,HN-03,HN-04,HN-05,HN-06,HN-07,HN-08,HN-09,HN-11,HN-12,HN-13,HN-15,HN-18,HN-19,HN-22和HN-25)中ALS酶活對苯磺隆的敏感性較敏感種群顯著降低,為敏感種群的23.45-55.97倍,非突變型抗性薺菜種群(HN-10,HN-14,HN-16,HN-17,HN-20,HN-21,HN-23,HN-24,HN-26,HN-27和HN-28)ALS酶活對苯磺隆的敏感性與敏感種群基本一致。以馬拉硫磷作為P450s酶抑制劑,研究了其對抗性種群HN-06苯磺隆抗性水平的影響。試驗結(jié)果表明,馬拉硫磷施用濃度為1000 g a.i.ha~(-1),可導致抗性薺菜種群對苯磺隆的敏感性提高,相較于敏感種群,抗性種群苯磺隆GR_(50)值下降25%。采用整株測定法測定了HN-06及HN-13兩個抗性種群對嘧草硫醚、雙氟磺草胺、啶磺草胺、氟唑磺隆及咪唑乙煙酸等ALS抑制劑類除草劑的交互抗性譜。結(jié)果表明,測定的2個苯磺隆抗性種群HN-06和HN-13均對ALS抑制劑類除草劑嘧草硫醚,雙氟磺草胺,啶磺草胺,氟唑磺隆產(chǎn)生了不同程度的高水平抗藥性;HN-06種群對咪唑乙煙酸表現(xiàn)敏感,HN-13種群對咪唑乙煙酸表現(xiàn)出低水平抗性,抗性倍數(shù)分別為1.1和5.6�？剐运j菜種群HN-05在光周期,溫度,pH,鹽脅迫,水勢及埋藏深度等環(huán)境因素方面與敏感種群HN-00相比不存在適合度代價。試驗結(jié)果表明,薺菜種子的萌發(fā)屬于光周期不敏感類型;薺菜種子最適萌發(fā)溫度為15-20℃;薺菜種子在pH=5-10范圍內(nèi)都有較高萌發(fā)率;薺菜種子的萌發(fā)對鹽脅迫敏感性不高;薺菜種子的萌發(fā)對滲透勢敏感;薺菜種子的出苗率在土壤表層時最高,隨著埋藏深度的增加其出苗率逐漸減少,當埋藏深度超過1.2cm時,薺菜的出苗將完全被抑制。本研究初步明確了我國河南省小麥田薺菜對苯磺隆的抗性分布情況及抗性水平。其中,雙ALS基因拷貝存在于薺菜植株中,抗性種群中ALS基因的表達量升高及ALS酶基因突變導致的靶標酶敏感性降低,是導致薺菜對苯磺隆產(chǎn)生抗性的重要原因。P450s酶活性增強導致的對除草劑的代謝抗性也是抗性種群產(chǎn)生抗性的重要原因之一,且可與靶標抗性機制在一株薺菜中同時存在。薺菜抗性種群對ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了不同程度的交互抗性。基于薺菜ALS基因序列分析,構建了快速檢測薺菜ALS基因突變的dCAPS分析方法。此外,本研究初步測定了在不同環(huán)境因素下薺菜的萌發(fā)、出苗的特性。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S451.221
【圖文】：

麥田雜草薺菜（Capsella bursa-pastoris (L.) Medik.）對苯磺隆抗性分子機制的研究雜草的抗藥性報道始于 20 世紀 50 年代，在 1957 年美國夏威夷州和加拿大略省分別發(fā)現(xiàn)鋪散鴨跖草（Commelina diffusa）和野胡蘿卜（Daucus caro苯氧羧酸類除草劑 2, 4-D 產(chǎn)生了抗藥性（Switzer, 1957; Whitehead and Swi963）。在 1970 年 Ryan Rick 報道了對莠去津和西瑪津產(chǎn)生抗性的歐洲千里Senecio vulgaris）（Ryan, 1970），此后抗藥性雜草報道案例逐年增加，幾乎線上升趨勢（圖 1-1）。

圖 1-2 全球不同作用機理除草劑抗性發(fā)展情況Figure 1-2 Chronological increase in resistant weeds to different mechanisms globally截至 2018 年 3 月，我國共有 27 種抗性雜草（共 43 個生物型）對 9 種作用機制的除草劑產(chǎn)生了抗藥性，抗性雜草生物型數(shù)量僅次于美國（160 種大利亞（90 種）、加拿大（67 種）、法國（50 種）和巴西（46 種），排在全六位 (Heap, 2018)。 截止目前，抗藥性雜草分布于全球 70 個國家的 86 物田， 在所有作物中小麥受抗藥性雜草危害最嚴重，共報道抗藥性雜草，其中抗 ALS 抑制劑類除草劑雜草高達 68 種（Heap, 2018）。這與 ALS劑類除草劑靶標明確、作用位點單一，以及在小麥田中長期大量、重復使用相關。在我國，抗性雜草主要分布在小麥、玉米、水稻等作物田中，其中 A制劑類除草劑抗藥性是發(fā)生最多的類型（表 1-1）。表 1-1 中國除草劑抗性雜草 (截止到 2018 年 3 月)Table 1-1 Herbicide resistant weeds in China (By March 2018)

合成酶（acetohydroxy acid synthase, AHAS, EC 2.2.1.6），是植物生命過程中三種重要的支鏈氨基酸異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸合成過程中第一步反應的關鍵酶（Devine and Shukla, 2000; Duggleby et al., 2008 ; Umbarger, 1978）。如圖1-3所示，ALS 既可以催化 1 分子的丙酮酸和 1 分子的 α-丁酮酸（2-ketobutyrate）生成 2-乙酰-2-羥基丁酸（2-aceto-2-hydroxybutyrate）作為異亮氨酸（Iso）合成的底物；也可以催化 2 分子的丙酮酸（pyruvate）生成乙酰乳酸（acetolactate）作為纈氨酸（Val）合成的底物；乙酰乳酸的后續(xù)產(chǎn)物 α-酮異戊酸（2-keto-isovalerate）與乙酰輔酶 A（acetyl-CoA）一起可作為合成亮氨酸（Leu）的底物（Aubert et al.,1997; Binder et al., 2007; McCourt et al., 2006; Schloss et al., 1988; Zhou et al.,2007）。

【參考文獻】

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本文編號：2768676