發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 17:18

【摘要】：本研究通過(guò)透射電鏡法觀察和RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)遼寧省沈陽(yáng)地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜葉片樣品中的病毒進(jìn)行了檢測(cè)與鑒定,確定侵染遼寧省沈陽(yáng)地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜的病毒為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)中的蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)。本文測(cè)定了三個(gè)TuMV遼寧分離物的全基因組和十六個(gè)TuMV遼寧分離物的外殼蛋白(coat protein,cp)序列,豐富了遼寧省沈陽(yáng)地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜病毒資源,為蘿卜病毒病的防治工作奠定理論基礎(chǔ)。(1)2017年5月,在遼寧省沈陽(yáng)市采集到6個(gè)呈現(xiàn)泡狀褪綠的蘿卜樣品,使用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察到700×13nm的線(xiàn)性病毒粒子。初步判定該病毒粒子為典Potyvius線(xiàn)性粒子。利用Potyvirus通用引物PVY-legpoty-F/R對(duì)所采集的樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后得到1200 bp片段,克隆測(cè)序后進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果表明該樣品同蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的同源性最高。利用已經(jīng)報(bào)道的擴(kuò)增TuMV特異引物TuMV-CP-F/R在6個(gè)樣品中均擴(kuò)增到約1000bp的片段,包含完整的外殼蛋白(coat protein,cp)。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),6個(gè)樣品的cp基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均高于90%,說(shuō)明他們是用一個(gè)病毒的不同分離物。選取LN-sy分離物,基于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上TuMV全基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增6對(duì)引物,TuMV-1F/1R,TuMV-2F/2R,TuMV-3F/3R,TuMV-4F/4R,TuMV-5F/5R,TuMV-6F/6R擴(kuò)增得到該樣品上病毒的全基因組。該病毒的基因組由9855個(gè)核苷酸組成。基于cp基因進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)沈陽(yáng)地區(qū)蘿卜樣品與TuMV的中國(guó)分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性為99.8%。基于cp基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)TuMV LN-sy與TuMV的中國(guó)分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)在同一分支上。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報(bào)告和2018版分類(lèi)系統(tǒng)中報(bào)道的Potyviridae分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),斷定LY-sy是TuMV的遼寧沈陽(yáng)分離物。(2)2017年5月,在遼寧省蓋州市采集10個(gè)呈現(xiàn)矮化或葉片斑駁的蘿卜樣品,使用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)在兩種癥狀病葉中均觀察到約800×13nm的線(xiàn)性病毒粒子。初步判定病樣受到Potyvius病毒侵染。利用(1)中TuMV-CP-F/R引物在10個(gè)樣品中均擴(kuò)到約1000bp的cp基因。選取矮化癥狀的TuMV-GZ1分離物和葉斑駁癥狀的TuMV-GZ5進(jìn)行全基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)TuMV-GZ1和TuMV-GZ5基因組分別為9867nt和9856nt組成�；赾p基因進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)TuMV-GZ1和TuMV-GZ5均與TuMV的中國(guó)分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性為99.4%�；赾p基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),兩個(gè)分離物與TuMV的中國(guó)分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)聚在同一分支上。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報(bào)告和2018版分類(lèi)系統(tǒng)中報(bào)道的Potyviridae分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),斷定TuMV-GZ1和TuMV-GZ5是TuMV的遼寧蓋州分離物。這是遼寧省首次報(bào)道蘿卜感染TuMV。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S436.31
【圖文】：

11圖 2.1 遼寧省沈陽(yáng)地區(qū)采集的蘿卜病葉圖片e of disease leaves of Raphanus sativus L.collected in Shenyang Province粒載體EN（天根生化科技（北京）有限公司）購(gòu)買(mǎi)大腸桿菌生物工程（大連）有限公司）購(gòu)買(mǎi) pMD-18T、pMD

第 2 章 沈陽(yáng)地區(qū)蘿卜病毒病的鑒定與序列分析結(jié)果分析卜病葉樣品電鏡觀察結(jié)果鮮蘿卜病葉于透射電鏡下，進(jìn)行病毒粒子觀察，可見(jiàn)約 700×病毒粒子表面無(wú)包膜（圖 2.2）。該病毒粒子從形態(tài)特征上顯示 Potyvirus 屬成員。osaic virus-[China: Brassica napus L. ] TuMV-[CN: Brassica napus L.] KF463308osaic virus-[China: Raphanus sativus] TuMV-[CN: Raphanus sativus] KR153038osaic virus-[China:Raphanus sativus] TuMV-[CN:Raphanus sativus] KR153040

沈陽(yáng)大學(xué)碩士學(xué)位論文 LN-sy1 樣品，利用六對(duì)引物（表 2.2）對(duì)蘿卜病葉的 cDNA 進(jìn)增，結(jié)果如圖 2.4 顯示，依次得到 1200bp（泳道 1）、1800bp（泳道 5）、1500bp（泳道 7）、1800bp（泳道 9）、1000bp（泳段，健康植物中無(wú)任何條帶（泳道 2、4、6、8、10 和 12）。所克隆測(cè)序，經(jīng)拼接得到全長(zhǎng)基因組序列。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766107