【摘要】：馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)嚴重威脅茄科作物的生產(chǎn),揭示PVY與寄主的互作關系,可為研究其致病機理及病害防治提供理論依據(jù)。前期研究發(fā)現(xiàn)普通煙(Nicotiana tabacum)編碼的氯離子通道蛋白CLC-Nt1可能與PVY編碼的6K2蛋白互作。本研究旨在通過多種生物化學與分子生物學手段,進一步揭示CLC-Nt1蛋白在PVY侵染過程中的作用機理,主要研究結果如下:(1)通過分段克隆以及無義突變的方法構建了PVY壞死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY~N)侵染性克隆PVY-S。該侵染性克隆可侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)、普通煙與番茄,并具有和野生病毒相似的致病力。在該侵染性克隆中分別插入表達了外源蛋白GFP、Rosea1及MtPsy2a,可直觀監(jiān)測PVY侵染進程,為研究PVY的致病機理提供一個有利工具。(2)通過病毒介導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、CRISPR/Cas9技術、回補實驗等方法證明CLC-Nt1蛋白參與植株的生長發(fā)育。利用GUS染色進行組織特異性表達分析,表明CLC-Nt1基因在根、莖、葉及花中均表達。通過亞細胞定位分析,發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與COP II小泡。利用對pH敏感的熒光蛋白探針(pHluorin),證明CLC-Nt1蛋白參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH。利用secreted GFP(secGFP)證明CLC-Nt1蛋白參與胞內(nèi)蛋白分泌途徑。(3)通過酵母雙雜交(Yeast two hybrid)、共定位分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)等方法,證明CLC-Nt1蛋白與6K2蛋白互作。利用對pH敏感的熒光蛋白探針,發(fā)現(xiàn)PVY侵染和單獨表達6K2蛋白均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH升高。通過病毒介導的基因沉默、CRISPR/Cas9技術、化學抑制劑等方法,發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白功能缺失后PVY的胞內(nèi)復制以及系統(tǒng)侵染均受到抑制,表明CLC-Nt1蛋白是PVY侵染所必需的一個寄主因子。根據(jù)上述結果得出結論:PVY侵染普通煙后通過自身編碼的6K2蛋白與普通煙的CLC-Nt1蛋白互作而調(diào)節(jié)CLC-Nt1蛋白功能,誘導細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH升高,利于PVY募集復制囊泡組分,從而促進病毒胞內(nèi)復制與系統(tǒng)侵染。本研究首次證明植物的CLC蛋白具有調(diào)節(jié)細胞器內(nèi)pH的功能,并首次從胞內(nèi)pH的角度分析植物病毒與寄主的互作關系,為今后作物抗病毒藥物的開發(fā)提供新的思路。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41
【圖文】：

tCLCd（von der Fecht-Bartenbach et al., 2007）及 AtCLCf 蛋白等（Marmagne et a膜片鉗技術在原位檢測跨膜離子流；而在爪蟾卵母細胞中異源表達這些 CLC果并不完全可靠，這些技術障礙限制了對此類 CLC 蛋白功能的理解。根據(jù)序AtCLCd 蛋白可能是 Cl-/H+逆向轉運蛋白而不是 Cl-通道蛋白（Zifarelli & Pusc同哺乳動物 CLC-4 及 CLC-5 蛋白一樣參與調(diào)節(jié)細胞器內(nèi) pH（Hara-Chikuma euma et al., 2005b; Mohammad-Panah et al., 2009）。利用一種可以準確檢測細胞料將有助于理解這些 Cl-/H+逆向轉運蛋白在細胞中的作用。白分泌途徑與細胞器內(nèi) pH 關系對pH敏感的熒光染料，例如：FITC（dextran-conjugated forms of fluorescein isotnn & Kosegarten, 1995）和 Oregon green（Christoph-Martin & Mühling, 2011），胞質(zhì)外體 pH；BCECF（2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxy fluorescein）arboxy seminaphthorhodafluor）被用來測定細胞質(zhì)和液泡內(nèi)的 pH（Gehring e et al., 1997; Gonugunta et al., 2008; Krebs et al., 2010）。然而這些熒光染料常會

士學位論文 ，并且不能特異性地區(qū)分不同細胞器，因此并不適用于檢測內(nèi)內(nèi) pH。除了熒光染料外，一些遺傳編碼的對 pH 敏感的熒光蛋白內(nèi)細胞器 pH。Miesenbock 首先鑒定到一個 GFP 突變體（pHlu 和 470nm 兩種波長激光激發(fā)出熒光，并且熒光強度比值隨 pH 變曲線后可根據(jù)光強比值準確計算蛋白周圍 pH（Miesenbock et al將 pHlurion 靶向至不同細胞器，實現(xiàn)無損傷、高特異性地檢測不ere 利用 pHluorin 檢測了擬南芥和煙草細胞內(nèi)膜系統(tǒng)細胞器內(nèi) pH內(nèi) pH 呈梯度降低趨勢；其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是 pH 最高也是蛋白分泌途H 最低，如圖 1.2（Martiniere et al., 2013; Shen et al., 2013）。

國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 引研究表明蛋白分泌途徑中細胞器內(nèi)的 pH 對蛋白分泌的正常進行至關重要，當一種或多種器內(nèi) pH 平衡狀態(tài)被打破時，蛋白質(zhì)的加工與分泌進程將受到嚴重的影響。例如，用 monenmonovalent ion-selective ionophore，一價離子選擇性離子載體）處理細胞，會引起反面高爾形態(tài)變化，破壞細胞器完整性（Mollenhauer et al., 1990）。進一步研究表明，monensin 會打面高爾基體膜內(nèi)外質(zhì)子梯度（Boss et al., 1984），抑制一些可溶性蛋白，如 phytohemaggluti及一些貯存蛋白前體的膜泡運輸（Matsuoka et al., 1990; Gomez & Chrispeels, 1993）。反面高體內(nèi)酸性環(huán)境改變還會影響可分泌蛋白翻譯后修飾以及加工進程（Carnell & Moore, 1994），貨物蛋白的目的地（Chanat & Huttner, 1991）。一些駐留蛋白，例如 TGN38 和 furin 的定Chapman & Munro, 1994），以及一些蛋白水解酶的運輸與成熟同樣依賴于細胞器內(nèi)環(huán)境 Schmidt & Moore, 1995）。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 魏梅生,李桂芬,陳燕芳,李明福;煙草環(huán)斑病毒無侵染性組分的分離[J];植物檢疫;2000年04期

2 延翠琴;謝清華;;食(藥)用菌常見侵染性病蟲害及防治方法[J];河南農(nóng)業(yè);2018年28期

3 江彤;張漢平;謝朝陽;陳靜;馮明峰;;草莓鑲脈病毒侵染性克隆的構建[J];植物病理學報;2016年02期

4 劉健;趙霏霏;陳應娟;吳陽晨;朱桐;席德慧;林宏輝;;辣椒脈斑駁病毒侵染性克隆構建的簡易方法[J];四川大學學報(自然科學版);2015年05期

5 魏景超;龔浩;潘仁瑞;;江蘇省的水稻爛秧問題[J];植物病理學報;1955年02期

6 廖乾生;杜志游;張華榮;吳鵬;朱麗萍;陳集雙;;黃瓜花葉病毒辣椒分離物侵染性克隆構建[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2008年07期

7 田波;朊病毒(侵染性蛋白質(zhì))的發(fā)現(xiàn)[J];微生物學通報;1984年06期

8 閆文凱;林文武;楊文婷;杜雅馨;吳祖建;楊靚;;竹花葉病毒福州分離物基因組序列分析及其侵染性克隆的構建[J];林業(yè)科學;2017年08期

9 薛朝陽,周雪平,陳青,戚益軍,曹海峰,李德葆;一種病毒侵染性全長cDNA克隆的快速構建方法[J];生物化學與生物物理學報;2000年03期

10 尚延智,陳振山,司永吉,滕冰;人參紅皮病發(fā)病原因探討[J];中藥材;1996年04期

相關會議論文 前10條

1 劉莉銘;彭斌;古勤生;;農(nóng)桿菌介導的黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染性克隆的構建及其相關的突變[A];植物病理學研究進展——中國植物病理學會第十二屆青年學術研討會論文選編[C];2015年

2 高瑞;田延平;王潔;陰筱;李向東;Jari Valkonen;;煙草脈帶花葉病毒侵染性cDNA克隆的構建與改造[A];植�？萍紕�(chuàng)新與病蟲防控專業(yè)化——中國植物保護學會2011年學術年會論文集[C];2011年

3 柏超;曹杰;;銀杏失綠、焦葉現(xiàn)象的原因與對策[A];2012北京園林綠化與宜居城市建設[C];2012年

4 何云蔚;阮小蕾;陳秀;劉福秀;李華平;;香蕉線條病毒侵染性克隆的構建[A];中國植物病理學會2009年學術年會論文集[C];2009年

5 劉澤;李強生;Avice M.Hall;Bruce D.L.Fitt;;油菜黑脛病原真菌的分離與鑒定[A];中國植物病理學會2008年學術年會論文集[C];2008年

6 韋繼光;黃翠流;于浩龍;莫冰萍;李貴玉;羅基同;趙庭坤;;桉樹病害的發(fā)生與為害[A];中國植病、菌物學會杭州聯(lián)合年會論文集[C];2008年

7 陳清華;趙添羽;張曉燕;王穎;張宗英;李大偉;于嘉林;韓成貴;;蕓薹黃化病毒含有GFP標記基因侵染性cDNA克隆的構建[A];中國植物病理學會2017年學術年會論文集[C];2017年

8 冀樹嫻;王璐;劉錦;耿超;李向東;田延平;;西瓜花葉病毒侵染性克隆的構建及其載體改造[A];中國植物病理學會2017年學術年會論文集[C];2017年

9 侯婉瑩;成卓敏;李世訪;;啤酒花矮化類病毒侵染性克隆的構建及其生物學活性[A];中國植物病理學會2009年學術年會論文集[C];2009年

10 黃顯德;王玉;程德杰;劉錦;閆志勇;田延平;李向東;;番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系侵染性克隆的構建及應用[A];中國植物病理學會2017年學術年會論文集[C];2017年

相關重要報紙文章 前5條

1 衡水市林果病蟲害防治檢疫站 張永強;如何防治楊樹非侵染性枯萎病[N];河北科技報;2010年

2 李新生;果樹修枝應及時使用愈合劑[N];山東科技報;2009年

3 曹滌環(huán) 廖華娟;綠化樹種對周邊果林的影響[N];中國綠色時報;2009年

4 曹滌環(huán) 廖華娟;謹防綠化樹種對周邊果林的影響[N];陜西科技報;2009年

5 受邀專家 山東省農(nóng)業(yè)廳果茶站 高文勝;桃提質(zhì)增效關鍵技術(三)[N];山東科技報;2014年

相關博士學位論文 前10條

1 劉莉銘;黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子致病性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2017年

2 孫航軍;馬鈴薯Y病毒侵染過程中煙草CLC-Nt1蛋白的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2018年

3 劉錦;黃瓜綠斑駁花葉病毒致病機制及其外殼蛋白互作蛋白功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2018年

4 庹德財;番木瓜畸形花葉病毒檢測鑒定及侵染性克隆構建與應用[D];海南大學;2015年

5 王強;玉米褪綠斑駁病毒侵染性克隆構建及致病機理初步研究[D];浙江大學;2015年

6 王芳;煙草PVY壞死株系侵染性克隆構建及致病機理研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學;2013年

7 鄭世玲;中國小麥花葉病毒侵染性克隆構建及運動蛋白的功能分析[D];浙江大學;2012年

8 宋震;柑橘碎葉病毒侵染性克隆構建及其誘導的基因沉默（VIGS）體系建立[D];西南大學;2013年

9 劉濤;利用侵染性cDNA研究甜菜壞死黃脈病毒RNA5與病毒致病性的關系[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2003年

10 高瑞;煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構建及其在交叉保護、外源蛋白表達及VIGS中的應用[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳梓茵;茉莉C病毒侵染性cDNA克隆的構建以及不同分離物CP基因的克隆和序列分析[D];福建農(nóng)林大學;2018年

2 張芬;中國小麥花葉病毒侵染性克隆構建及其與宿主HSP70互作研究[D];浙江師范大學;2017年

3 許帥;黃瓜綠斑駁花葉病毒遺傳多樣性分析及侵染性克隆的構建[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2016年

4 金圣塔;一株番茄不孕病毒全基因組序列與侵染性克隆研究[D];浙江理工大學;2011年

5 王艷嬌;柑橘脈突病毒侵染性克隆構建及其基因沉默抑制子鑒定[D];西南大學;2017年

6 談s

本文編號：2764617