【摘要】：大麥?zhǔn)鞘澜缟现匾暮坦阮?lèi)作物,種植面積廣,在我國(guó)也有悠久的栽種歷史,其主要用作牲畜飼料、食品加工原料以及釀造啤酒等。大麥黃花葉病是土傳病毒,病毒寄生于土壤中禾谷多黏菌的孢子中,具有發(fā)病范圍廣,傳播速度快,感染率高的特點(diǎn),對(duì)冬大麥品種造成產(chǎn)量損失甚至達(dá)到半數(shù)以上。轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗外界脅迫中起著重要的作用。本課題對(duì)大麥中的NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究,尋找與大麥黃花葉病相關(guān)的NAC基因,并對(duì)其功能進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象采用大麥黃花葉病易感品種Morex,Igri以及Barke,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定感染大麥黃花葉病致病相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);通過(guò)通路克隆的技術(shù)得到與大麥黃花葉病相關(guān)的兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該基因的表達(dá)特征和與其他物種的進(jìn)化關(guān)系;構(gòu)建載體后進(jìn)行由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位;采用酵母雙雜技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白。了解大麥感染BaMMV中兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子HvNAC6(HORVU5Hr1G011650)和HvNAC7(HORVU7Hr1G106480)的作用,為后期培育抗大麥黃花葉病品種提供基礎(chǔ)。1.參考依據(jù)RNA-seq分析的結(jié)果,在本轉(zhuǎn)錄本共37,804個(gè)基因中,在用大麥黃花葉病感染Igri幼苗前后,有效差異表達(dá)的基因數(shù)為10,164個(gè),其中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)為5,192個(gè),下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)為4,972個(gè)。其中預(yù)測(cè)得到了534個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,分屬與多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子家族。2.大麥感染BaMMV前后進(jìn)行RNA-seq分析后,HvNAC6和HvNAC7有明顯表達(dá)的上調(diào)。通過(guò)組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),HvNAC6多在結(jié)實(shí)后期以及外穎殼中都有顯著表達(dá),但是在幼嫩的新生穗中沒(méi)有表達(dá),新生穗中有微弱的表達(dá)。HvNAC7在苗根中有顯著的表達(dá)。由保守結(jié)構(gòu)域分析,兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子都具有NAC家族保守結(jié)構(gòu)域。3.由農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)感染煙草對(duì)HvNAC6和HvNAC7進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示兩者都是核定位蛋白,在細(xì)胞核中的行使相應(yīng)的功能。4.轉(zhuǎn)錄因子在酵母系統(tǒng)中與BaMMV病毒蛋白構(gòu)建、易感因子eIF4E、隱性抗病基因PDIL5-1進(jìn)行酵母雙雜交,結(jié)果沒(méi)發(fā)現(xiàn)有蛋白互作。這表明其并沒(méi)有直接作用于感染BaMMV的過(guò)程中,可能多作為一個(gè)調(diào)控或者是修飾的轉(zhuǎn)錄因子的存在于這個(gè)過(guò)程中。5.通過(guò)qRT-pcr技術(shù)分析HvNAC6和HvNAC7在在抗感材料中的表達(dá)差異。只發(fā)現(xiàn)HvNAC7在24份大麥黃花葉病感病材料中的表達(dá)水平顯著高于24份抗病材料中表達(dá)水平,表明HvNAC7與大麥黃花葉病感染的響應(yīng)調(diào)控有著重要的關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S435.123
【圖文】：

毒粒子也能夠獲得足夠的蛋白，這使得病毒在土壤中能夠存活許時(shí)間通常發(fā)生在秋季，而葉片上的病理癥狀的出現(xiàn)通常是在冬季病植株的主要表現(xiàn)癥狀是葉片出現(xiàn)淺綠色和黃色的色素沉著同時(shí)大麥被病毒侵染后，其植株分蘗數(shù)降低，出現(xiàn)矮小發(fā)育不良的癥和粒重也嚴(yán)重降低[20,21]。大麥黃花葉病的發(fā)病程度還受到輪作的種類(lèi)與數(shù)量、外界環(huán)境的氣溫以及空氣濕度等因素的影響。在植，老葉以及嫩葉的上端部分不容易出現(xiàn)病癥，這個(gè)現(xiàn)象可能與植有著密切關(guān)系[22]。在新葉出現(xiàn)病斑之前，使用 RT-PCR/ELISA 技對(duì)低的接種的部位及根細(xì)胞和新葉新生部位檢測(cè)到病毒的。隨著病毒侵入大麥葉綠體后不斷復(fù)制，導(dǎo)致葉綠體脹腫裂解，光合作用，繼而發(fā)生病害[24]。然而，大麥黃花葉病在植株體內(nèi)的待研究。

8圖 1-2 已定位對(duì) BaYMV 和 BaMMV 有抗性/耐受性的基因座的遺傳位置Fig. 1-2 Genetic position of mapped loci conferring resistance / tolerance to BaYMV and BaMMV.The diagram was integrated and modified from Ordon et al. (2005) and Hiroomi et al. (2011)1.2.5 大麥黃花葉病的抗病育種大麥黃花葉病是通過(guò)土壤中的禾谷多黏菌為媒介進(jìn)行傳播的，土壤中的禾谷多黏菌數(shù)目多并且其休眠孢子具有很強(qiáng)的生存能力，禾谷多黏菌寄生于土壤和植物根系中，所以采用農(nóng)藥等化學(xué)方法很難對(duì)病害起到有效的防治。因此，唯一可持續(xù)的保護(hù)大麥作物的有效途徑就是提高大麥品種自身對(duì)大麥黃花葉病的抵抗力，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的大麥種質(zhì)資源的系統(tǒng)檢測(cè)以鑒定出對(duì)病害表現(xiàn)抗性的基因型并選育和推廣對(duì)大麥黃

activation regions，TARs）且保守性很低。Ooka 等[67]對(duì)擬南芥和水稻測(cè)序預(yù)測(cè)分析，將 NAC 蛋白可分為兩大類(lèi)（Group I 和 Group II）和 18 亞類(lèi)。NAC 轉(zhuǎn)錄因子 N 端的結(jié)構(gòu)域含有約 130~150 個(gè)氨基酸，可分為 A-E5 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，其中 A 可能與二聚體形成有關(guān)，C 和 D 可以識(shí)別特定啟動(dòng)子以結(jié)合 DNA，同時(shí) D 亞結(jié)構(gòu)還含有一個(gè)疏水性的負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)有抑制轉(zhuǎn)錄活性的功能。A、C、D 亞結(jié)構(gòu)非常保守，而 B 和 E 亞結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)就相對(duì)多變保守性較低，這使得轉(zhuǎn)錄因子的功能具有多樣性。而在低保守性的 C端，通常由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成，比如 Thr-Ser，Pro-Glu。NAC 蛋白的寡聚化位點(diǎn)位于 NAC 結(jié)構(gòu)域，而蛋白 C 端序列會(huì)影響 NAC 成員之間的寡聚化作用[69]。隨著科學(xué)技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)鑒定了越來(lái)越多的 NAC 轉(zhuǎn)錄因子。NAC 基因家族成員很多，到目前為止，在水稻中發(fā)現(xiàn) 149 個(gè) NAC 成員，大豆中有 101 個(gè)，擬南芥中發(fā)現(xiàn) 106個(gè)，煙草中含有 152 個(gè) NAC 成員。

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本文編號(hào)：2763808