【摘要】：番木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。根據(jù)寄主范圍的不同,PRSV可分為P和W兩個株系,其中W株系(PRSV-W)只侵染葫蘆科作物,引起花葉和果實環(huán)斑等癥狀,嚴重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。近年PRSV-W在山東、河南等地區(qū)的發(fā)生呈上升趨勢。本研究制備了PRSV-W抗血清,分析了葫蘆科作物品種對PRSV的抗性,測定了弱毒突變體對野生型PRSV的交叉保護效果。主要研究結果如下:1、利用原核表達的衣殼蛋白制備了效價高、特異性強的PRSV抗血清。將PRSV-W衣殼蛋白(CP)基因連接到原核表達載體pEHISTEV上,獲得重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。經(jīng)誘導可表達出約37 kD的蛋白,最適IPTG終濃度0.2 mmol/L、誘導時間4 h。經(jīng)ELISA檢測,抗血清效價為1:8192。Western blotting結果表明,該抗血清只與PRSV-W侵染的西葫蘆有特異性反應,而與健康西葫蘆、西瓜花葉病毒侵染的西葫蘆和馬鈴薯Y病毒侵染的普通煙均無反應。2、通過室內(nèi)接種試驗鑒定了55個葫蘆科作物品種對PRSV的抗性。在鑒定的13個黃瓜品種中,唐山秋美、精選唐山秋瓜、耐熱王中王和遼研翠玉4個品種的病情指數(shù)分別為32.2、34.4、37.8和38.9,屬于中抗品種,其余均為感病或高感品種;七葉早南瓜、瑞麗甜蜜本、日本南瓜和一品甜紅栗的病情指數(shù)介于31.1與39.4之間,屬于中抗品種。長豐肉絲瓜和常豐長香絲瓜的病情指數(shù)分別為50.5和54.4,屬于感病品種。13個甜瓜品種、11個西瓜品種、11個西葫蘆品種和2個瓠瓜品種,病情指數(shù)都在60以上,屬于高感品種;3、測定了三個弱毒突變體對野生型PRSV的交叉保護效果。在保護間隔期為5天時,三個弱毒突變體均沒有表現(xiàn)出交叉保護效果。在保護間隔期為10天時,挑戰(zhàn)接種后15天,弱毒突變體N137A預先接種的西葫蘆植株均無明顯癥狀,保護效率為100%,與只接種野生型植株相比,預先接種N137A的西葫蘆植株中病毒粒子的積累量顯著降低;弱毒突變體N346A能夠延遲發(fā)病15天;弱毒突變體V417A沒有表現(xiàn)出交叉保護效果。在保護間隔期為15天時,N137A的保護效率為100%;N346A的保護效率為26.7%,V417A仍然無明顯的交叉保護效果。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文表達及抗血清的制備的擴增與測序分析物 Nco I-F 和 BamH I-R 對 PRSV CP 基基因片段，切膠回收后與原核表達載體，過夜連接后得到重組質(zhì)粒 pEHISTEV測定證明其開放閱讀框正確。

切膠回收后與原核表達載體 ，過夜連接后得到重組質(zhì)粒 pEHISTEV測定證明其開放閱讀框正確。圖 3-1 PRSV CP 基因的擴增Fig.3-1 PCR product of PRSV CP gene

V CP 的誘導表達及 SDS-PAGE 分析測序正確的 pEHISTEV-PRSV-CP 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta，為了表達條件，菌液經(jīng)不同的IPTG濃度和時間誘導后進行SDS-PAG明，除了未經(jīng) IPTG 誘導的菌液外，在不同的時間及 IPTG 濃度在 37 kD 附近表達出了蛋白條帶（圖 3-4 和圖 3-3），與預期大 kD 蛋白是 PRSV-W CP 基因與原核表達載體 pEHISTEV 上的白酶酶切位點基因表達的融合蛋白。另外在 IPTG 的不同濃度CP 的表達量并未表現(xiàn)出明顯的差異（圖 3-3）；在不同誘導時蛋白在 1 h 時即可表達，隨后表達量增加，但是在 4 h 后表達明顯的變化（圖 3-4）。所以我們將 IPTG 終濃度為 0.2 mmol/Lh 確定為 PRSV CP 的最適誘導表達條件。

【參考文獻】

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本文編號：2763147