【摘要】：棗(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科(Rhamnaceae)植物,是我國(guó)的重要果樹(shù)樹(shù)種。棗樹(shù)的栽培過(guò)程中常常伴隨著病蟲(chóng)害的發(fā)生,其中最為嚴(yán)重的是由植原體侵染而引起的棗瘋病,堪稱棗樹(shù)的癌癥。為研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在棗瘋病發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮的作用以及棗與植原體的相互作用機(jī)制,利用生物信息學(xué)的方法,鑒定出棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,并對(duì)棗瘋病發(fā)病過(guò)程中部分棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析和熒光定量PCR試驗(yàn)驗(yàn)證,同時(shí)分析了水楊酸和茉莉酸甲酯處理后幾個(gè)棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量變化。主要結(jié)果如下:1、通過(guò)嫁接轉(zhuǎn)染植原體,提取植原體侵染后不同時(shí)期的棗葉片RNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)信息,鑒定出69個(gè)棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子,并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建,染色體定位,保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)及基序分析。結(jié)果顯示69個(gè)棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子都含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域,可分為Group I,Group II以及Group III 3個(gè)亞組,分別含有17、41、11個(gè)成員,且不均勻的分布在棗樹(shù)的12條染色體上,在7號(hào)染色體上沒(méi)有匹配到相應(yīng)的ZjWRKY轉(zhuǎn)錄因子。2、從棗瘋病發(fā)生過(guò)程中棗葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測(cè)到28個(gè)ZjWRKY轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)主要集中在嫁接后38-52 w。對(duì)表達(dá)量上調(diào)的6個(gè)基因ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果顯示在棗瘋病發(fā)病過(guò)程中ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61、ZjWRKY69基因表達(dá)量發(fā)生明顯變化(上調(diào))。說(shuō)明這幾個(gè)基因可能在棗樹(shù)防御植原體的過(guò)程中發(fā)揮作用。3、為進(jìn)一步分析研究棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植原體防御過(guò)程中的潛在作用,我們用水楊酸和茉莉酸甲酯處理?xiàng)椗吲嗝?熒光定量PCR檢測(cè)ZjWRKY5、ZjWRKY8、ZjWRKY42、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因在處理不同時(shí)間的表達(dá)量變化,試驗(yàn)結(jié)果顯示SA處理后,ZjWRKY42和ZjWRKY52的表達(dá)量顯著升高;MeJA的積累誘導(dǎo)了ZjWRKY42和ZjWRKY61的表達(dá)量發(fā)生較明顯變化。4、構(gòu)建了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因的過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草,分別獲得了15個(gè)轉(zhuǎn)ZjWRKY8基因的抗性芽,28個(gè)轉(zhuǎn)ZjWRKY52基因的抗性芽,16個(gè)轉(zhuǎn)ZjWRKY61基因的抗性芽。5、ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61基因在煙草葉片中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)后,用0.1 mol·L~(-1)的H_2O_2處理葉片,結(jié)果顯示ZjWRKY8、ZjWRKY61基因過(guò)表達(dá)的煙草葉片中CAT的活性水平都高于對(duì)照,而SOD活性只在0-12 h高于對(duì)照葉片;DAB組織化學(xué)染色結(jié)果顯示ZjWRKY8過(guò)表達(dá)的煙草葉片中黃色沉淀明顯增加。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S436.65
【圖文】：

3.2 棗 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥 WRKY 家族的進(jìn)化樹(shù)分析及其分類(lèi)依據(jù)棗WRKY蛋白與擬南芥WRKY蛋白的相似性進(jìn)行聚類(lèi)分析，將69個(gè)WRKY蛋白分為3個(gè)組Group I、Group II和Group III，且與擬南芥的分組相對(duì)應(yīng)。根據(jù)棗與擬南芥的同源進(jìn)化樹(shù)（圖2-1）可以看出，有17個(gè)ZjWRKY屬于Group I；Group II中含有41個(gè)WRKY成員，可細(xì)分為II a 、II b、II c、II d、II e 5個(gè)亞組，所含WRKY成員分別為3個(gè)、11個(gè)、15個(gè)、3個(gè)、9個(gè)；Group III含有11個(gè)ZjWRKY成員。由圖2-1發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)分組中均包含有AtWRKYs和ZjWRKYs，如Group I中有17個(gè)棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子，13個(gè)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，說(shuō)明兩個(gè)物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蛋白結(jié)構(gòu)上有一定的保守性。同一個(gè)分組內(nèi)

Fig. 2-1 The phylogenetic tree of WRKY transcription factors in jujube and Arabidopsis3.3 棗 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的染色體定位利用Mapinspect軟件對(duì)棗WRKY蛋白進(jìn)行染色體定位，結(jié)果如圖2-2（圖左側(cè)cM為基因圖距單位），只有43個(gè)棗WRKY基因可以定位到棗的11條染色體上，26個(gè)棗WRKY基因沒(méi)有可以匹配的染色體定位信息（未獲得染色體定位信息）。在棗的12條染色體上，7號(hào)染色體上沒(méi)有定位到任何棗WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其余11條染色體上都分布有不等數(shù)量的棗WRKY基因。11號(hào)染色體上分布最多，含有8個(gè)ZjWRKY基因（ZjWRKY30- ZjWRKY37），占11.60%，其次是1號(hào)染色體

我們利用DNAMAN軟件對(duì)棗WRKY蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子都含有WRKYGQK的保守結(jié)構(gòu)，而ZjWRKY23、ZjWRKY46是WRKYGKK結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都屬于GroupII c亞組（圖2-3）。利用MEME在線工具對(duì)棗WRKY蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到10個(gè)保守基序，并將其命名為motif 1-motif 10（圖2-4）。motif 1和motif 2包含有WRKY蛋白標(biāo)志性的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域。motif 1結(jié)構(gòu)最為保守，ZjWRKY40（Group II c）和ZjWRKY49（Group II b）以外的67個(gè)棗WRKY蛋白均含有該結(jié)構(gòu)。10個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子不含有motif 2結(jié)構(gòu)，分別為Group I的ZjWRKY1、11、49，GroupII a的ZjWRKY48，Group II b的ZjWRKY40、54，Group II e的ZjWRKY42以及Group III中的ZjWRKY3、13、26。其次motif 3、4、5也較為保守

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2761832