【摘要】：稻瘟病是限制水稻高產(chǎn)的主要病害之一。由于稻瘟病菌生理小種的易變性,所推廣的抗稻瘟病品種常常在種植不久之后就喪失其抗病性,導(dǎo)致其失去使用價(jià)值。因此,快速、有效地篩選和利用優(yōu)良的抗稻瘟病品種一直是國內(nèi)外研究重點(diǎn)。其中,抗稻瘟病基因分子鑒定是水稻抗稻瘟病材料輔助選擇的重要方面。針對(duì)目前抗稻瘟病基因分子鑒定主要是以DNA為模板定性檢測(cè)水稻中抗性基因的有無及組成,不能鑒定抗稻瘟病功能基因是否表達(dá)的不足,本文以水稻所含的稻瘟病抗性基因(已被克隆,且為江蘇省水稻品種的主要抗病基因)為對(duì)象,集成和研發(fā)了抗稻瘟病功能基因組成、表達(dá)鑒定和病菌接種鑒定技術(shù)體系。主要研究結(jié)果如下:1.稻瘟病菌的培養(yǎng)及接種方法比較本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)所收集和保存的稻瘟病菌進(jìn)行培養(yǎng),獲得稻瘟病菌孢子液。在此期間對(duì)水稻進(jìn)行培養(yǎng),于三葉一心期分別用噴施法、創(chuàng)傷法、誘發(fā)法進(jìn)行稻瘟病菌接種,結(jié)果表明,創(chuàng)傷法對(duì)水稻傷害較大,易造成水稻枯萎,影響結(jié)果。所以噴施法接種相對(duì)較好。2.抗稻瘟病基因鑒定方法的研發(fā)、集成與應(yīng)用利用水稻稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記,研發(fā)了同時(shí)檢測(cè)稻瘟病抗性基因Pikh與Pi1的多重PCR體系,集成了同時(shí)檢測(cè)稻瘟病抗性基因Pita與Pib的多重PCR體系。由于Pikm是由兩個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因組成,故建立了分別檢測(cè)Pikm1-TS和Pikm2-TS兩個(gè)片段的Pikm基因鑒定方法。并用這兩套體系和Pikm基因鑒定方法對(duì)江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的114份雜交后代水稻材料中的抗病基因Pita、Pib、Pikh、Pi1和Pikm進(jìn)行了檢測(cè),以確定這些雜交后代水稻材料中抗稻瘟病基因的分布情況。檢測(cè)結(jié)果表明,114份材料中含抗稻瘟病基因Pita的有81份,含Pib的有106份,含Pikh的有35份,含Pikm的有13份,含Pi1的僅有3份。分別占檢測(cè)材料的71.0%、92.9%、30.7%、11.4%、2.6%,表明了Pib、Pita和Pikh這三個(gè)抗稻瘟病基因廣泛存在于江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的雜交后代水稻材料中。這可能與該公司在雜交配組時(shí)注重對(duì)抗稻瘟病親本的選擇和選育過程中長(zhǎng)期注重對(duì)稻瘟病抗性的篩選有關(guān)。3.水稻對(duì)穗頸瘟抗性的稻瘟病菌接種鑒定對(duì)田間水稻進(jìn)行稻瘟病菌接種,接種7 d后進(jìn)行病情調(diào)查。穗頸瘟接種鑒定結(jié)果表明:114份材料中經(jīng)人工接種鑒定表現(xiàn)為高抗的有2份,抗病的有27份,中抗的有32份,感病的有33份,高感的有20份。分別占鑒定總數(shù)的1.7%、23.7%、28.1%、28.9%、17.5%�？沟疚敛』蚝退腩i瘟抗性之間的相關(guān)性分析表明:Pita、Pikh基因與穗頸瘟的抗性呈顯著(P0.05)的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.297、0.239。Pib、Pi1和Pikm基因與穗頸瘟的抗性之間相關(guān)性不顯著。4.水稻對(duì)稻瘟病抗性的基因表達(dá)評(píng)價(jià)本試驗(yàn)針對(duì)多數(shù)育種單位不具備配備熒光定量PCR儀的實(shí)際情況,研發(fā)了抗稻瘟病基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR便捷檢測(cè)技術(shù)。以Ubq5為內(nèi)參,選擇Pb、Pita和Pikh為抗性基因進(jìn)行檢測(cè)。在所抽檢的11個(gè)材料中,盡管Pita基因是組成型表達(dá),但經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在抗稻瘟病材料中該基因的表達(dá)仍然受到稻瘟病菌接種的誘導(dǎo)。Pikh和Pib基因是誘導(dǎo)型表達(dá),稻瘟病菌接種后Pikh和Pib基因在抗稻瘟病材料中上調(diào)表達(dá),而在感稻瘟病材料中Pikh和Pib基因均明顯下調(diào)表達(dá)。這表明,在抗稻瘟病水稻材料中抗稻瘟病基因Pib、Pita和Pikh的表達(dá)受到稻瘟病菌接種處理的誘導(dǎo),而在感稻瘟病水稻材料中這種表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯,甚至Pikh和Pib基因出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。這一方面說明,抗稻瘟病基因表達(dá)水平可用于對(duì)含有抗稻瘟病主效基因水稻品種的抗性評(píng)價(jià),另一方面說明,瘟病菌接種處理后抗稻瘟病基因的差異表達(dá)能更合理解釋在生產(chǎn)上某些含有抗稻瘟病主效基因的水稻品種其抗性經(jīng)常表現(xiàn)不理想的現(xiàn)象。5.水稻受稻瘟病侵染標(biāo)志基因預(yù)測(cè)方法的建立根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)結(jié)果,篩選出一個(gè)有可能作為一個(gè)水稻是否受到稻瘟病侵染的標(biāo)志基因(Barwin),經(jīng)本文所研發(fā)的半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不管在抗稻瘟病材料還是感稻瘟病材料中Barwin基因均隨稻瘟病菌接種時(shí)間的推移其表達(dá)量逐步升高。因此,可通過檢測(cè)Barwin基因表達(dá)水平隨時(shí)間的變化來預(yù)測(cè)特定品種或特定田塊的水稻是否受到稻瘟病侵染。6.感稻瘟病材料標(biāo)志基因表達(dá)鑒定方法的建立根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)結(jié)果,篩選出兩個(gè)有可能作為感稻瘟病水稻材料鑒定的標(biāo)志基因,即與防御相關(guān)的幾丁質(zhì)酶3和葡聚糖內(nèi)切-β-1,3-葡萄糖苷酶基因。據(jù)此,本文設(shè)計(jì)引物并建立了這兩個(gè)基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR檢測(cè)方法。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)基因的表達(dá)在感稻瘟病水稻材料中受到稻瘟病菌接種的顯著誘導(dǎo),在抗稻瘟病材料中未見表達(dá)或者表達(dá)量很低。因此,可以通過檢測(cè)這兩個(gè)基因在稻瘟病菌接種條件下的表達(dá)水平鑒別某水稻材料是否為感稻瘟病材料。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.41
【圖文】：

以去年己鑒定的４個(gè)材料，Ｐ３２邋（含有尸／ｔｏ、Ｐ／６、朽姑、Ｐｚ７基因）、Ｐ１６５邋（含Ｐ沾基逡逑因）、Ｐ１７８邋（含戶／ｔｏ、尸訪、Ｐ／妨基因）、Ｐ２１８邋（含Ｐ／６、乃７基因）為ＤＮＡ模板進(jìn)行ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見圖３－３。圖３－３表明，本試驗(yàn)己成功研發(fā)出能同時(shí)檢測(cè)Ｐ／從和Ｐ／７逡逑基因的多重ＰＣＲ體系Ｉ，同時(shí)建立了能同時(shí)檢測(cè)和乃Ｙａ基因多重ＰＣＲ體系ＩＩ，并且逡逑能擴(kuò)增出和八７、和基因片段清晰的條帶（圖３－３）。逡逑圖３－３體系Ｉ和體系ＩＩＰＣＲ擴(kuò)增優(yōu)化結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｔｈｅ邋ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｓｙｓｔｅｍ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑注：Ａ表示體系Ｉ的優(yōu)化結(jié)果；Ｂ表示體系ＩＩ的優(yōu)化結(jié)果。逡逑利用水稻抗稻瘟病基因Ｐ／妨和Ｐｚ７、Ｐ／ｔａ和的多重ＰＣＲ檢測(cè)體系，于２０１７年對(duì)逡逑江蘇潤揚(yáng)種業(yè)股份有限公司所選育的１１４份雜交后代水稻材料中的抗稻瘟病基因組成進(jìn)行逡逑了檢測(cè)，不同水稻材料中抗稻瘟病基因組成的多重ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果圖３－４和３－５所示，圖３－４逡逑顯示了朽似和Ｐ沾的檢測(cè)結(jié)果，圖３－５顯示了邋Ｐ／Ｍ和八７的檢測(cè)結(jié)果。含乃Ｙａ、／％和尸拙、逡逑朽７基因的材料可以分別擴(kuò)增出１０２４邋ｂｐ、３６５邋ｂｐ和２１６／３５９邋ｂｐ、４６０邋ｂｐ的特異性片段，不逡逑含抗性基因的材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)，１１４份材料中含稻瘟病基因Ｐ／ｔｏ的８１份，含逡逑Ｐ泌的有１０６份，含尸焌的３５份

注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋１８?jìng)�(gè)循環(huán)；２０個(gè)循環(huán)；２２個(gè)循環(huán)；２４個(gè)循環(huán)；２６個(gè)循環(huán)；２８?jìng)�(gè)循環(huán)。逡逑將２２個(gè)材料分為抗稻瘟病和感稻瘟病兩組，分別進(jìn)行模板濃度的調(diào)試，使各個(gè)材料逡逑在２４個(gè)循環(huán)時(shí)Ｕｂｑ５的亮度保持一致。調(diào)試結(jié)果如圖３－８和圖３－９。圖中結(jié)果表明，各樣逡逑品ｃＤＮＡ濃度基本調(diào)適一致，可以進(jìn)行各基因的半定量分析。逡逑

邐４３逡逑ｉ？§：Ｌ—．羞」逡逑圖３－８抗稻瘟病材料模板濃度的調(diào)試結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－８邋Ｄｅｂｕｇｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｒｉｃｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋】０３５處理、ｊ0３５對(duì)照、ＪＩ０４５處理、〗０４５對(duì)照、】０５９處理、ｊ0５９對(duì)照、ｊ0７０逡逑處理、Ｊ０７０對(duì)照、Ｊ０８５處理、Ｊ０８５對(duì)照、Ｊｌｌ丨處理、川１對(duì)照、Ｊ１３１處理、Ｊ１３１對(duì)照材料的Ｕｂｑ５表逡逑達(dá)量。逡逑圖３－９感稻瘟病材料模板濃度的調(diào)試結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－９邋Ｄｅｂｕｇｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｒｉｃｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ邋ｍａｔｅｒｉａｌ逡逑注：從左至右依次是Ｍａｋｅｒ；邋Ｋ）１９處理、＊Ｊ０１９對(duì)照、Ｊ０２４處理、Ｊ０２４對(duì)照、＊１０６５處理、Ｊ０６５對(duì)照、Ｊ１２５逡逑處理、Ｊ１２５對(duì)照材料的Ｕｂｑ５表達(dá)量。逡逑３．邋７．邋２抗稻瘟病基因表達(dá)水平的半定量ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)逡逑對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行循環(huán)數(shù)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2761174