【摘要】：花生瘡痂病(Elsino?arachidis)是我國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)的重要的真菌病害。近年來(lái),發(fā)生普遍,危害嚴(yán)重,現(xiàn)已成為花生產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展中亟待解決的植保問(wèn)題。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),該病菌能夠產(chǎn)生一種橘紅色、具有光敏活性的傒醌類(lèi)真菌毒素,經(jīng)鑒定為痂囊腔菌素(Elsinochrome,ESC)。傒醌類(lèi)毒素影響寄主植物的代謝過(guò)程,在Alternaria,Cercospora和Elsino?等多種重要病原真菌侵染過(guò)程中作為重要的致病因子和毒力因子發(fā)揮作用。探究植物病原真菌毒素在病原菌致病過(guò)程中的作用及方式、生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制,對(duì)于揭示病原菌侵染途徑、致病機(jī)制和互作機(jī)理具有重要意義。由于國(guó)內(nèi)外尚缺乏花生瘡痂病菌的全基因組信息和分子研究體系,病菌致病因子、毒力相關(guān)次生代謝、ESC毒素生物合成途徑、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不明確,病菌侵染和致病、變異和進(jìn)化、寄主與病原互作分子機(jī)制研究尚屬空白,無(wú)法為抗病育種和防控策略創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)。本文通過(guò)對(duì)花生瘡痂病菌光生物學(xué)分析,并通過(guò)對(duì)全基因組序列分析及毒素合成相關(guān)基因簇的挖掘,初步預(yù)測(cè)毒素的生物合成途徑調(diào)控基因,為花生瘡痂病菌致病機(jī)制的研究及毒素的生物合成機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。1.明確了花生瘡痂病菌光生物學(xué)光對(duì)真菌生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝具有重要調(diào)控作用。通過(guò)系統(tǒng)研究光質(zhì)、光強(qiáng)和光周期對(duì)E.arachidis(LN-JH-C01、LN-SY-A01和LN-FT-H01)菌落形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育及毒素含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),光參與病菌生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝。光強(qiáng)度0~20μEm~(-2)s~(-1)為菌株生長(zhǎng)最適范圍,30d菌落直徑可達(dá)20.07~23.83mm,光強(qiáng)大于100μEm~(-2)s~(-1)時(shí),生長(zhǎng)速率減小,菌落直徑僅為11.67~19.00mm;藍(lán)光培養(yǎng)條件下,菌落直徑最大,30d可達(dá)21.03~23.00mm,紅光和綠光處理下,僅為15.27~18.13mm;不同光周期處理對(duì)菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。產(chǎn)毒最適光強(qiáng)為100μEm~(-2)s~(-1),30d產(chǎn)毒量為31.63~82.31 nmol plug~(-1),光強(qiáng)為200μEm~(-2)s~(-1)時(shí),產(chǎn)毒量顯著降低,僅為4.04~10.35 nmol plug~(-1);藍(lán)光處理毒素含量增加,3株菌株分別為79.00 nmol plug~(-1),27.68nmol plug~(-1)和87.10 nmol plug~(-1),紅光和黑暗條件下,未檢測(cè)到毒素。研究表明,光參與花生瘡痂病菌毒素的生物合成,但Elsino?種間影響效應(yīng)明顯不同,供試菌株中E.ampelina受光強(qiáng)、光質(zhì)和光周期變化影響相對(duì)較小。2.探究了花生瘡痂病菌毒素組分及其生物活性花生瘡痂病菌毒素經(jīng)分離純化,得到R_f值為分別為0.025,0.05,0.18,0.4和0.5的五種不同組分,全波長(zhǎng)光譜掃描發(fā)現(xiàn),五種組分的紫外吸收峰存在明顯差異,其中組分1和組分2的紫外吸收峰分別位于460nm和516nm,其它3種組分與粗毒素的紫外吸收峰位點(diǎn)相同,分別在460nm,516nm和560nm。生物活性測(cè)定發(fā)現(xiàn),各組分均可引起幼嫩花生葉片(15d)產(chǎn)生壞死斑,其中組分2所引致的壞死面積最大,但接種成熟葉片(45d)后,只有組分2和組分3可引致壞死斑。接種毒素后葉片活性氧清除酶CAT、POD和SOD動(dòng)態(tài)變化測(cè)定結(jié)果表明,組分2和組分3接種后,酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì),且組分2和組分3接種后葉片的電導(dǎo)率隨接種時(shí)間增加而升高,96h達(dá)最大值,分別為82.95%和78.37%。電導(dǎo)率變化是監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜完整性的指標(biāo),研究證明了毒素導(dǎo)致寄主細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷,致使細(xì)胞死亡的主要原因之一,明確了花生瘡痂病菌毒素在致病過(guò)程中的生理機(jī)制。3.首次揭示了花生瘡痂病菌全基因組生物信息學(xué)信息花生瘡痂病菌全基因組序列測(cè)序經(jīng)拼接、組裝和注釋后,獲得6.28 Gb的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù),基因組總長(zhǎng)約為33.18 Mb,GC含量為48.24%。基因組包含9174個(gè)蛋白編碼基因,其中編碼分泌蛋白的基因比例為8.0%(734個(gè)分泌蛋白),轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因(TCDB)124個(gè),含有信號(hào)肽的蛋白編碼基因949個(gè),跨膜蛋白編碼基因1,829個(gè),以及127個(gè)非編碼RNA和13個(gè)假基因。通過(guò)基因組功能注釋分析,共有8644個(gè)蛋白編碼基因被注釋得到(94.22%),其中GO,KEGG以及KOG分析分別注釋到3237個(gè)、3055個(gè)和4958個(gè)基因,分別占基因總數(shù)的35.28%、33.30%和54.04%�；蚬δ茏⑨尳Y(jié)果中占比較高的為翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)和分子伴侶,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝。此外還注釋到與病原菌自身解毒作用相關(guān)基因和抗氧化活性功能基因。基因組與PHI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比得到2,752個(gè)基因,約占30.0%,其中包括次生代謝合成關(guān)鍵基因,細(xì)胞色素P450,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)基因。通過(guò)分子數(shù)據(jù)分析獲得CAZy(602個(gè))、細(xì)胞色素P450(79個(gè))以及ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(57個(gè))和MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(190個(gè))等基因家族中致病相關(guān)基因。花生瘡痂病菌基因組信息分析和挖掘?yàn)檫M(jìn)一步深入探索病菌致病機(jī)制和毒素生物合成途徑奠定了可靠的分子數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.明確了次生代謝相關(guān)PKS基因簇功能信息及ESCB1光表達(dá)調(diào)控使用antiSMASH2在線工具對(duì)E.arachidis的基因組序列中次生代謝基因簇進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),基因組中含有PKS,NRPS和PKS-NRPS等基因簇在內(nèi)的86條次生代謝基因簇,經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,其中有6個(gè)與ESC(EVM0003759,定名為ESCB1),Melanin(EVM0004732、EVM0005880)和T-toxin(EVM0005988、EVM0002563、EVM0006869)生物合成相關(guān)的聚酮合酶基因。光暗處理下ESCB1表達(dá)量與毒素產(chǎn)生量趨勢(shì)相同,光下表達(dá)量顯著高于黑暗處理,進(jìn)一步證明ESCB1是ESC生物合成的關(guān)鍵基因,且其合成途徑與光緊密聯(lián)系。ESCB1所在PKS基因簇共含有13個(gè)預(yù)測(cè)基因,主要包括MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因2個(gè)(EVM0006582和EVM0006794),細(xì)胞色素P450基因1個(gè)(EVM0002495),單氧酶編碼基因1個(gè)(EVM0001150),甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因2個(gè)(EVM0007299和EVM0001135),水解酶編碼基因1個(gè)(EVM0008491)及Zinc finger轉(zhuǎn)錄因子1個(gè)(EVM0002638)等�；虼鼗蚬δ茴A(yù)測(cè)對(duì)于ESC毒素生物合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S435.652
【圖文】：

異尾孢菌素（Isocercosporin）Cercospora spp.卡弗他丁C (Calphostin C)枝孢素(Cladochrome)弗萊菌素（Phleichrome）Cladosporium cucumerinumCladosporium cladosporioidesCladosporium phlei痂囊腔菌素（Elsinochromes） Elsino species竹紅菌素（Hypocrellins）異竹紅菌素（Isohypocrellin）Hypocrella bambusaeGraphis hematites菌寄生菌素（HypomycinA）竹黃菌素（Shiraiachromes）其他傒醌類(lèi)Other perylenequinonesHypomyces spp.Shiraia bambusicolaBulgaria inquinans4,9-dihydroxy-3,10-perylenequinone Cercosporin Elsinochromes Phleichrome

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖1-2 尾孢菌素生物合成途徑Fig.1-2 Cercosporin biosynthesis pathway（Margaret et al. 2009）近年來(lái)在對(duì)ESC的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)除efPKS1基因調(diào)控ESC的合成外，另有其他相關(guān)基因參與調(diào)控作用，且控制ESC合成的基因簇尚不明確。傒醌類(lèi)真菌毒素的生物合成是在多種酶的催化和復(fù)雜的基因調(diào)控下完成的，因此明確該毒素生物合成途徑、催化酶系統(tǒng)、代謝機(jī)理、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需要更加深入的研究。1.5 傒醌類(lèi)真菌毒素的應(yīng)用及展望卡弗他丁C（Calphostin C）是蛋白激酶C的有效抑制劑，并且也已被用于癌癥治療的研究（Olivo et al. 2007）。Hypocrellins及其相關(guān)衍生物已在國(guó)內(nèi)被用于藥物研究，并且已對(duì)它們?cè)诠鈩?dòng)力學(xué)腫瘤治療中的用途以及它們的抗病毒性質(zhì)進(jìn)行了廣泛研究。相關(guān)的金絲桃素是用作抑郁癥的草藥的圣約翰草（Hypericum perforatum）的組分（Nahrstedtet al. 2010）。盡管金絲桃素作為抗癌劑具有缺陷，但是金絲桃素的衍生物正在被合成并且在光動(dòng)力學(xué)腫瘤治療中被測(cè)試（Waser et al. 2007）。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文LN-FT-H01，LN-JH-C01，LN-SY-A01 雖然在菌落形態(tài)上差異明顯，但進(jìn)化樹(shù)分析顯示（圖 2-1A），供試三株病原菌均屬于花生瘡痂病菌。2.2.2 光強(qiáng)對(duì)病原菌生長(zhǎng)發(fā)育及毒素產(chǎn)生的影響2.2.2.1 光強(qiáng)對(duì)病原菌菌落形態(tài)和菌絲生長(zhǎng)的影響光強(qiáng)對(duì)于花生瘡痂病菌的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率有顯著影響（圖 2-2）。光強(qiáng)度在 5~20μE m-2s-1的變化范圍內(nèi)，花生瘡痂病菌的菌落形態(tài)無(wú)明顯差異，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落邊緣有明顯暗紅色暈圈。而光強(qiáng)為 50μE m-2s-1或更高強(qiáng)度的光處理?xiàng)l件下，菌落形態(tài)上更加緊湊致密，LN-FT-H01 和 LN-JH-C01 氣生菌絲著紅色。光強(qiáng)度 0~20μE m-2s-1為花生瘡痂病菌生長(zhǎng)最適光強(qiáng)范圍，菌落直徑為 20.67 ~23.83mm。光強(qiáng)大于 50μE m-2s-1，菌落直徑隨光強(qiáng)增大而降低，200μE m-2s-1菌落直徑僅為 11.67~13.13mm。不同種間對(duì)于光強(qiáng)的響應(yīng)差異明顯，E. ampelina 菌落直徑變化較小，并且菌落顏色均呈暗紅色，形態(tài)無(wú)明顯變化。而 E. fawcettii 在 0-200 Jm-2s-1光強(qiáng)度處理下與 E. arachidis表現(xiàn)出相似的光適應(yīng)性。

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