【摘要】：由Valsa mali引起的蘋果樹腐爛病是危害蘋果生產(chǎn)最為嚴(yán)重的病害之一,該病菌主要侵染皮層和韌皮部,導(dǎo)致樹皮腐爛,嚴(yán)重時(shí)可致整樹枯死,但基因組序列的缺乏嚴(yán)重限制了在分子水平對其致病機(jī)理的解析。病原菌與植物長期的協(xié)同進(jìn)化過程中,病菌分泌毒性蛋白來調(diào)控植物的生理過程和免疫反應(yīng)以促進(jìn)病菌的侵染,但這些蛋白也很容易被植物識別并激發(fā)免疫反應(yīng)。利用基因組分析研究蘋果樹腐爛病菌適應(yīng)性侵染定殖樹皮的機(jī)理,明確病菌分泌的毒性蛋白被植物識別的機(jī)制,將有助于理解病害的成災(zāi)規(guī)律、植物的抗病機(jī)制及制定有效的防治策略。因此,本研究在完成了蘋果樹腐爛病菌基因組測序的基礎(chǔ)上,通過進(jìn)行比較基因組分析及致病相關(guān)基因的預(yù)測鑒定,并探明了鑒定到的兩個(gè)病菌分泌蛋白VmPR1c和VmEXLX1被植物識別的機(jī)制,獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:基因數(shù)量和基因水平轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)蘋果樹腐爛病菌適應(yīng)性定殖樹皮。利用高通量測序及光學(xué)圖譜輔助拼接,獲得了高質(zhì)量的V.mali基因組序列,其完整度為96.7%,包括13條染色體級別的scaffolds。V.mali分泌蛋白酶的最適pH大多為酸性,并發(fā)現(xiàn)對真菌在酸性環(huán)境中正常生長至關(guān)重要的G01家族在V.mali基因組中顯著擴(kuò)張。V.mali基因組含有大量的胞壁降解酶類,但相比其它真菌擴(kuò)張的主要為果膠酶類,而降解木質(zhì)纖維相關(guān)酶類相對較少,并且降解木質(zhì)素的關(guān)鍵酶AA5家族基因在腐爛菌基因組中缺失;此外,大部分果膠酶基因在侵染過程顯著上調(diào)表達(dá),經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示,腐爛菌主要降解蘋果樹皮中的果膠。相比其它真菌,V.mali的次生代謝基因簇?cái)?shù)量顯著增多,在侵染過程上調(diào)表達(dá)的主要為非核糖體多肽類基因。基因水平轉(zhuǎn)移分析鑒定到的32個(gè)基因,功能涉及與環(huán)境微生物競爭、氮利用和致病等,可能在驅(qū)動(dòng)病菌適應(yīng)性定殖樹皮中發(fā)揮重要作用。Expansin-like蛋白VmEXLX1被植物SRLK識別。VmEXLX1在侵染早期上調(diào)表達(dá),表明VmEXLX1可能是重要的致病因子。過表達(dá)該基因后,病菌的致病力顯著降低,在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并顯著提高本氏煙對核盤菌的抗性,表明VmEXLX1可被植物識別并激發(fā)免疫反應(yīng)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),VmEXLX1定位于植物細(xì)胞膜,并且信號肽缺失后不能在煙草中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,表明VmEXLX1很可能在質(zhì)外體發(fā)揮功能。進(jìn)一步利用質(zhì)譜、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀分析,在本氏煙中鑒定到一個(gè)與VmEXLX1互作的受體激酶NbSRLK1。瞬時(shí)表達(dá)NbSRLK1可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、ROS積累和胼胝質(zhì)沉積,且NbSRLK1促進(jìn)VmEXLX1的降解,而VmEXLX1促進(jìn)NbSRLK1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。PR1-like蛋白VmPR1c被植物Skp1降解后激發(fā)免疫反應(yīng)。三個(gè)PR1-like基因在病菌侵染早期都上調(diào)表達(dá),其中VmPR1c敲除和過表達(dá)突變體的致病力都顯著降低,且在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、ROS積累和胼胝質(zhì)沉積,表明VmPR1c被植物識別并激發(fā)免疫反應(yīng)。通過刪除突變和western blot分析發(fā)現(xiàn),VmPR1c誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要翻譯后修飾;信號肽缺失則不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,信號肽切割位點(diǎn)附近的插入或刪除突變均可影響蛋白的降解、翻譯后修飾和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。蛋白酶體和溶酶體抑制劑處理,都不能有效抑制VmPR1c的降解;進(jìn)一步的刪除和點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn),CAP功能域中的3個(gè)α螺旋區(qū)域單獨(dú)都能介導(dǎo)GFP融合蛋白的降解,而NTE和CTE功能域中的脯氨酸則起保護(hù)蛋白的作用。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明,VmPR1c定位于植物的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。通過酵母雙雜交篩選及雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證,鑒定到一個(gè)蘋果的互作蛋白MdSkp1。瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),MdSkp1可以顯著促進(jìn)VmPR1c的降解及其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,并且VmPR1c不能在沉默NbSkp1的本氏煙中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,表明Skp1識別并介導(dǎo)了VmPR1c誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.611.11
【圖文】：

因組學(xué)分析不僅發(fā)現(xiàn)毒性基因通常位于活躍的基因組區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)基因水平物病原真菌的基因組重塑具有重要作用。一個(gè)寄主特異性蛋白類毒素基因 To 個(gè) hAT 轉(zhuǎn) 座 酶 基 因 被 發(fā) 現(xiàn) 從 S. nodorum 水 平 轉(zhuǎn) 移 到 Pyreni-repentis(Friesen et al., 2006)。除了基因水平轉(zhuǎn)移，最新研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)染色體也轉(zhuǎn)移。番茄致病菌 F. oxysporum 的一些特異的染色體可以從致病菌株轉(zhuǎn)移到非，進(jìn)而產(chǎn)生新的致病菌株(Ma et al., 2010)�；蛩睫D(zhuǎn)移不僅可以在同一物種離株間發(fā)生，也可在不同物種間發(fā)生甚至跨界轉(zhuǎn)移，如細(xì)菌-真菌、真菌-卵nes & Richards, 2014)。應(yīng)蛋白是病菌分泌的促進(jìn)侵染定殖的蛋白，通常與寄主植物的蛋白發(fā)生互作序列的完成，極大地加快了新的效應(yīng)蛋白的鑒定。效應(yīng)蛋白通常是小的分泌功能未知(Rep, 2005)。候選效應(yīng)蛋白通常從蛋白組序列中預(yù)測得到（圖 1-1）, 2016)。然而，大量基于基因組學(xué)分析鑒定到的候選基因仍缺乏深入的研究。列為預(yù)測鑒定重要毒性基因提供了寶貴資源，而進(jìn)一步的基因功能分析（如反）將有助于明確這些基因的功能。

物病原真菌 Pyrenophora teres 和 Pyrenophora tritici-repentis 基因組中只鑒定到 16 個(gè)HGTs，占基因總數(shù)的 0.1%(Sun et al., 2013)；在 6 個(gè)植物基因組的 4866 個(gè)基因中只鑒定到 9 個(gè)真菌相關(guān)的 HGTs，占比不到 0.2%(Richards et al., 2009)。相比細(xì)菌基因組，真菌基因組的進(jìn)化主要來自于基因家族擴(kuò)張、基因復(fù)制、基因缺失等(Wapinski et al., 2007)。盡管 HGT 對真菌基因組的進(jìn)化影響較小，但對真菌生物學(xué)表型的影響很可能非常顯著，如提高真菌對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性。例如，真菌中對糖代謝和環(huán)境適應(yīng)性非常重要的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很可能經(jīng)歷了多次 HGT 過程(Coelho et al., 2013)。HGT 還可以顯著影響植物病原真菌的致病性。已被試驗(yàn)驗(yàn)證功能的數(shù)十個(gè)真菌 HGT 在破壞植物細(xì)胞壁、利用植物營養(yǎng)、干擾植物生理過程和免疫反應(yīng)等方面具有重要作用(Soanes & Richards, 2014)。真菌是滲透營養(yǎng)菌，需要通過分泌大量水解酶類降解大分子物質(zhì)進(jìn)而利用膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白獲取營養(yǎng)(Richards & Talbot, 2013)。除了獲取營養(yǎng)，植物病原真菌分泌的水解酶類還可以降解植物細(xì)胞壁以促進(jìn)侵染。植物細(xì)胞壁由果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等多糖構(gòu)成，是抵御病原菌入侵的物理屏障。利用生物信息方法從多個(gè)病原真菌基因組中鑒定到了多種胞壁降解酶類的 HGTs，如果膠酶、阿魏酸酯酶、木聚糖酶等（圖 1-2）(Richards& Talbot, 2013)。這些 HGTs 的獲得，很可能有利于病菌破壞植物細(xì)胞壁。

嘧茨騁?clade 內(nèi)的基因包含進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)的物種的基因（圖1-3）。通過系統(tǒng)發(fā)育樹 bootstrap 值的高低和基因是否發(fā)生多次的復(fù)制或缺失來判斷是否為 HGT，但基因的復(fù)制和缺失，經(jīng)常導(dǎo)致其系統(tǒng)發(fā)育樹類似于 HGT（圖 1-4）。因此，還可以通過基因的功能注釋進(jìn)一步確認(rèn)。比如，進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間共有的基因，其4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2748171