【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的單鏈RNA分子,在植物生長發(fā)育及各種抗逆響應中均發(fā)揮著重要的作用。目前,對植物mi RNA的研究已越來越深入,但關于miRNA對真菌響應機制的報道還不夠廣泛,尤其是草莓mi RNA。本研究以八倍體‘艷麗’草莓為試材,將灰霉病菌誘導后的紅熟期草莓果實進行小RNA組測序,從而鑒定出感染灰霉病菌的草莓果實中的miRNA和靶基因,篩選出差異表達的miRNA,并對靶基因進行功能預測分析,以探究草莓miRNA對灰霉病菌的響應。主要結果如下;1.分別采用灰霉病菌處理后48 h(T1)、72 h(T2)、96 h(T3)和120 h(T4)的草莓紅熟期果實,以及無菌水處理的草莓紅熟期果實(CK1)和灰霉病菌(CK2)為試材,構建了六個小RNA文庫,發(fā)現檢測到的小RNA長度以21 nt為首。在六個文庫中檢測到隸屬于58個miRNA家族的141個保守miRNA,以及35個新的miRNA。并對這176個miRNA進行靶基因預測,分別在保守miRNA和新miRNA中預測到506和287個靶基因,這些靶基因的種類主要是SPL,NAC,HL-Zip,TMV,LRR,F-box/kelch,MYB和一些抗病相關的基因。2.利用高通量測序技術,對灰霉病菌誘導的草莓果實miRNA進行差異表達分析,結果顯示:與CK1相比,大部分保守miRNA和新miRNA在感病初期(T1、T2)是上調表達的,感病后期(T3、T4)又呈下調表達。選取其中6個差異表達miRNA(miR166a,miR167,miR5290a,fan-18,fan-20,fan-24),利用qRT-PCR技術進行表達量的驗證分析,結果表明兩種表達量分析方法檢測到的結果基本一致。3.以‘艷麗’草莓果實為試材,采用RT-PCR技術成功克隆了草莓mi R5290a的靶基因PIRL,該基因編碼區(qū)全長1554 bp,編碼517個氨基酸。運用qRT-PCR技術分析了PIRL基因在灰霉病菌不同處理時間中的差異表達,發(fā)現其表達量下調,并在T2和T3時期的表達趨勢與miR5290a相反,推測mi R5290a負調控靶基因PIRL的表達。4.以植物pRI101-AN為載體,通過添加內含子序列,以及兩段反向互補的PIRL特異片段,利用Xbal I/Smal I和Kpn I/EcoR I限制性核酸內切酶,獲得含PIRL特異片段的干擾載體。運用快速PCR定點突變技術,獲得了mi R5290a的靶向位點消除,但翻譯的氨基酸序列不變的mPIRL序列,在此基礎上以植物pRI101-AN為載體,利用Nde I/Kpn I限制性核酸內切酶,獲得含mPIRL編碼區(qū)序列的過表達載體。5.利用農桿菌介導的遺傳轉化方法,獲得了過表達mPIRL基因的3個轉基因‘Ruegen’草莓株系。對3個轉基因株系進行表達量檢測,結果表明3個草莓株系中mPIRL的表達量遠遠高于對照,由此可推斷3株均為轉基因植株。6.將獲得的含mPIRL過表達載體和PIRL干擾載體的菌液注射進‘艷麗’草莓的白果中,并在白果轉紅期用灰霉病菌菌液進行處理,觀察表型發(fā)現:與無菌水處理的CK相比,mPIRL過表達的果實表型感病較輕,而PIRL干擾的果實表型感病較重。由此推測,PIRL參與草莓抗灰霉病的響應機制。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.68
【圖文】：

圖 1 文庫構建流程圖Fig. 1 Flow chart of Library Construction息學分析得的原始序列進行質量檢測和控制，將質量值低的、5’接頭

圖 2 六個文庫中的小 RNA 長度大小分布Fig. 2 Size distribution of small RNAs in six libraries.這些 miRNA 家族中，miR1511（32 個），miR7782（23 個）和 miR159（大的家族，均含有 17 個以上的家族成員。另外，miR156（7 個），miR166（96（3 個），miR5290（3 個），miR319（2 個）以及 miR5289（2 個）也是含

【參考文獻】

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本文編號：2724204