【摘要】：家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)一種外形呈桿狀的細(xì)胞核DNA病毒,特異性地感染家蠶細(xì)胞(Bombyx mori Linnaeus)。病毒感染后,細(xì)胞中病毒蛋白在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)大量表達(dá),致使病毒蛋白來(lái)不及折疊而大量累積,從而誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒防御反應(yīng)。自噬就是細(xì)胞的一種內(nèi)在抗病毒防御反應(yīng)。本研究以家蠶細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白BmGABARAP、BmLC3D及病毒多角體蛋白(polyhedrin)為對(duì)象,研究BmNPV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。主要結(jié)果如下:1.家蠶中自噬相關(guān)基因8(atg8)的進(jìn)化分析及分類(lèi)以人類(lèi)ATG8家族蛋白氨基酸序列為搜索序列,在NCBI已公布的273個(gè)昆蟲(chóng)物種的部分基因組或全基因組序列中進(jìn)行BLASTP檢索,共檢索到208個(gè)蛋白序列。利用MEGA7.0軟件的MUSCLE法進(jìn)行多序列比對(duì),GBLOCK軟件對(duì)不對(duì)稱(chēng)序列及多變性序列進(jìn)行剪切,獲得相對(duì)保守序列,并用MEGA7.0最大似然算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。相對(duì)人類(lèi)ATG8家族蛋白的GATE-16、GABARAP、LC3三個(gè)亞家族,昆蟲(chóng)基因組不編碼GATE-16,故昆蟲(chóng)ATG8家族蛋白分為2個(gè)亞家族:GABARAP亞家族和LC3亞家族。家蠶基因組編碼的兩個(gè)ATG8:BGIBMGA011783-TA和BGIBMGA010251-PA分別屬于GABARAP亞家族和LC3亞家族,并分別命名為BmGABARAP和BmLC3D。已有的文獻(xiàn)報(bào)道表明BmGABARAP是家蠶的一個(gè)自噬體標(biāo)記蛋白。本研究表達(dá)了BmLC3D N-端與eGFP的融合蛋白eGFP-LC3D,Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了eGFP-LC3D的II條帶,但分子量只有約39.0 kDa;激光共聚焦掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)BmLC3D與BmGABARAP共定位于自噬體。這些結(jié)果表明BmLC3D是家蠶基因組編碼的另一個(gè)自噬體標(biāo)記蛋白。ATG8家族蛋白在ATG4切割加工后才能在自噬途徑中發(fā)揮作用。利用定點(diǎn)突變技術(shù)分別對(duì)BmGABARAP和BmLC3D的G116和G100進(jìn)行突變,Western blot檢測(cè)表明第G116和G100位甘氨酸分別為BmGABARAP和BmLC3D的ATG4切割位點(diǎn)。G100突變的BmLC3D在細(xì)胞中仍能形成斑點(diǎn)狀的自噬體。理論上講,BGIBMGA010251-PA含245個(gè)氨基酸(amino acid,aa)。根據(jù)BLASTP分析時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè),BGIBMGA010251-PA是一個(gè)前體蛋白,含有2個(gè)ATG8結(jié)構(gòu)域:(1).aa1-100,與eGFP融合后即為eGFP-LC3D;(2).aa 101-245。該序列被命名為cleaved LC3D(cLC3D)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)cLC3D也是ATG8家族蛋白新成員。對(duì)此仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。2、BmNPV感染誘導(dǎo)自噬發(fā)生運(yùn)用BmGABARAP的兔源多克隆抗體對(duì)BmNPV感染誘導(dǎo)的自噬進(jìn)行了研究。Western blot分析表明,培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分逐漸損耗(Medium nutrient depletion stress,MND-Stress)時(shí),在32 h時(shí)即可檢測(cè)到微弱的BmGABARAP-II條帶,表明細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,隨著營(yíng)養(yǎng)成分的消耗,細(xì)胞自噬緩慢增強(qiáng);構(gòu)建BmGABARAP(或BmLC3D)與eGFP的融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后,發(fā)現(xiàn)BmGABARAP形成的自噬體成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu),而B(niǎo)mLC3D的自噬體幾乎不存在。用BmNPV T3感染BmN細(xì)胞,在0 h p.i.即能檢測(cè)到BmGABARAP-II條帶,隨著B(niǎo)mNPV的持續(xù)感染,BmGABARAP-II的量持續(xù)增加,表明細(xì)胞自噬增強(qiáng)。用熒光顯微鏡可觀察到BmGABARAP及BmLC3D的自噬體,其形狀呈空腔狀,明顯區(qū)別于MND-Stress形成的自噬體;且含有自噬體的細(xì)胞百分比高于MND-Stress下的百分比。以上結(jié)果表明,BmNPV感染BmN細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬。3.多角體蛋白參與細(xì)胞自噬的初步研究研究顯示,多角體蛋白和自噬標(biāo)記蛋白BmLC3D共定位于自噬體;Co-IP顯示二者有相互作用,表明多角體蛋白參與細(xì)胞自噬,且含有和ATG8相互作用的基序(ATG8 interaction motif,AIM)。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的多角體蛋白可能的AIM基序中關(guān)鍵氨基酸(W或F)進(jìn)行突變,Western blot分析表明多角體蛋白的~(47)WDLL~(50)氨基酸片段是多角體蛋白和BmGABARAP相互作用的基序(GABARAP interaction motif,GIM)。多角體蛋白與BmLC3D相互作用的AIM有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S884.51
【圖文】：

圖 1.1 29 種已知桿狀病毒的全基因進(jìn)化樹(shù)[6]1 Neighbour-joining tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus cor構(gòu)建是基于 29 種桿狀病毒的核心基因的氨基酸序列及基因組序列構(gòu)建而大于 50%。輔助程序值大于 95%的在分支有標(biāo)注。ning tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus core genes ofes. The alignment comprised 16349 positions. All branches have bootstrap vues >95% are given along the branches.用毒是已知昆蟲(chóng)病毒的重要組成部分，隨著對(duì)桿狀病毒了解的深入桿狀病毒因其宿主特異性，基于此點(diǎn)研發(fā)的生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)于人很好的安全性。20 世紀(jì) 30 年代北美開(kāi)始利用桿狀病毒成功防治蟲(chóng)核型多角體病毒作為商品制劑的注冊(cè)成功都是對(duì)桿狀病毒作為桿狀病毒作為生物殺蟲(chóng)劑相對(duì)于化學(xué)殺蟲(chóng)劑還是存在殺蟲(chóng)周期長(zhǎng)

圖 1.3 自噬分類(lèi)圖Figure 1 .3 Schematic representation of the different types of au生過(guò)程及分子機(jī)制生的顯著特征是形成自噬體，因此自噬發(fā)生過(guò)程通常需要經(jīng)環(huán)境及新陳代謝壓力下，mTOR 活性被抑制，ULK1 復(fù)合體位于吞噬泡膜上，自噬起始[24]。在兩個(gè)類(lèi)泛素化系統(tǒng)的作用關(guān)基因（autophagy-related geneAtg）編碼的自噬相關(guān)蛋白 起著 E3 泛素連接酶的作用，幫助 E2 泛素結(jié)合酶 ATG3 酯化在自噬體膜的延伸過(guò)程中需要降解的蛋白或細(xì)胞器在自噬受隨著膜的延伸自噬體形成閉合環(huán)狀雙膜結(jié)構(gòu)[29]。緊接著自噬成自噬溶酶體，內(nèi)部貨物被降解成小分子物質(zhì)，繼續(xù)參與細(xì)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 前田進(jìn);張志芳;;家蠶重組BmNPV表達(dá)的昆蟲(chóng)專(zhuān)一性神經(jīng)毒素的殺蟲(chóng)效應(yīng)[J];國(guó)外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1993年03期

本文編號(hào)：2723179