【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一,它廣泛的適應(yīng)性和高產(chǎn)性能使水稻生產(chǎn)具有巨大社會(huì)意義和重要的戰(zhàn)略意義,在糧食危機(jī)愈演愈烈和人口總數(shù)不斷增長的歷史背景下,全世界對(duì)水稻生產(chǎn)的期望也越來越高。據(jù)預(yù)測(cè),到2050年,水稻產(chǎn)量在現(xiàn)有基礎(chǔ)上翻一番才能基本滿足不斷增長人口需求。水稻病害是造成稻谷產(chǎn)量下降的主要原因之一,如水稻三大病害之一的稻瘟病每年給水稻造成11-30%的產(chǎn)量損失。盡管化學(xué)防治對(duì)水稻病害效果顯著,但由于施用時(shí)期局限、病原菌抗藥性增強(qiáng)、對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染和對(duì)稻米品質(zhì)的關(guān)注提高,一定程度上限制了化學(xué)藥劑的使用。與之相反,抗病水稻品種的選育及大面積推廣卻是多年來被證明為防治病害最經(jīng)濟(jì)、最有效和最安全的解決途徑。本論文研究內(nèi)容涉及植物生理學(xué)、生物化學(xué)、定量蛋白值組學(xué)等技術(shù),研究內(nèi)容主要包括(1)通過體外標(biāo)記技術(shù)(iTRAQ)結(jié)合高通量的質(zhì)譜鑒定平臺(tái)(LC-MS/MS),對(duì)水稻響應(yīng)稻瘟菌侵染脅迫時(shí),不同時(shí)間段葉片樣本蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行研究;(2)對(duì)不同抗性水稻品種響應(yīng)稻瘟菌侵染脅迫時(shí)葉片樣本蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量研究;(3)通過生物信息學(xué)手段結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,旨在找到稻瘟菌侵染水稻時(shí),水稻發(fā)生差異表達(dá)的蛋白,從而從分子水平闡明抗病性機(jī)制,為培育優(yōu)質(zhì)、抗病的水稻新品種奠定基礎(chǔ),推動(dòng)水稻抗稻瘟菌的分子機(jī)制研究。本論文的主要結(jié)果是:1)在水稻對(duì)稻瘟菌侵染不同時(shí)間脅迫應(yīng)答的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,我們提取谷梅2號(hào)在稻瘟菌(Guy11)侵染0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后的葉片蛋白,進(jìn)行定量、酶解及標(biāo)記處理,再根據(jù)肽段特征,將復(fù)雜肽段進(jìn)行SCX柱的初級(jí)分離,最后通過LC-MS/MS高通量質(zhì)譜鑒定平臺(tái)(ABSECXTripleTOFTM4600)進(jìn)行圖譜采集。通過ProteinPilot4.5軟件(ABSCIEX,FosterCity)針對(duì)280,528條Oryzasativa蛋白序列進(jìn)行搜索。數(shù)據(jù)采集時(shí),對(duì)每個(gè)組分進(jìn)行兩次技術(shù)重復(fù),即共采集20個(gè)組分,每10個(gè)組分采集圖譜經(jīng)過軟件整合到一個(gè)文件中,每個(gè)文件分別針對(duì)Oryzasativa庫進(jìn)行比對(duì)搜索,兩次結(jié)果表為Repeat 1 和 Repeat2。結(jié)果顯示,Repeat 1 在 FDR 為 1.0%時(shí),共鑒定到 33,373 Spectral,15,835條肽,1,604 個(gè)蛋白。Repeat2 在 FDR 為 1.0%時(shí),共鑒定到 33,004 Spectral,15,800條肽,1,581個(gè)蛋白。取2個(gè)及2個(gè)以上肽段支持的蛋白作為分析的結(jié)果。結(jié)果表明,Repeat1共有1,234個(gè)蛋白,Repeat2共有1,210個(gè)蛋白。根據(jù)上述得到的結(jié)果,將兩次實(shí)驗(yàn)得到的蛋白進(jìn)行分類,分為上調(diào)和下調(diào),將ratio值大于1.2的標(biāo)為上調(diào),小于0.8的標(biāo)為下調(diào),去除只有一次鑒定到的且趨勢(shì)不一致的蛋白,剩余蛋白分為五組:在稻瘟菌侵染24小時(shí)和48小時(shí)后,蛋白表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間段都上調(diào)的一組共121個(gè)蛋白;稻瘟菌侵染24小時(shí)和48小時(shí)后,蛋白表達(dá)量有一時(shí)間段上調(diào)的一組共26個(gè)蛋白;稻瘟菌侵染24小時(shí)和48小時(shí)后,蛋白表達(dá)量有一時(shí)間段下調(diào)的一組共34個(gè)蛋白;稻瘟菌侵染24小時(shí)和48小時(shí)后,蛋白表達(dá)量有一時(shí)間段上調(diào)且另一時(shí)間段下調(diào)的一組共43個(gè)蛋白;稻瘟菌侵染24小時(shí)和48小時(shí)后,蛋白表達(dá)量兩個(gè)時(shí)間段都下調(diào)的一組共148個(gè)蛋白。對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析、GO分類和KEGG-pathway分析,結(jié)果表明,這些差異表達(dá)蛋白共在79個(gè)通路中起著關(guān)鍵作用,參與較多的為光合作用途徑;對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分泌蛋白分析,發(fā)現(xiàn)其中61個(gè)蛋白具有信號(hào)肽,可能為分泌蛋白。進(jìn)行GO enrichment分析時(shí),發(fā)現(xiàn)在TCA循環(huán)、NADP代謝過程、異構(gòu)酶活性等15個(gè)分類中有富集;我們還將這些蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析,通過string在線分析發(fā)現(xiàn),有314個(gè)功能被String數(shù)據(jù)庫收錄,分析顯示,這314個(gè)蛋白存在相互作用,有兩類蛋白發(fā)生聚類現(xiàn)象,對(duì)這些蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這兩類蛋白分別為:一類為光合相關(guān)蛋白,另一類為核糖體相關(guān)蛋白。這兩類蛋白在水稻中起著重要功能,光合相關(guān)蛋白參與光合作用,提供能量;核糖體蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。提示在稻瘟菌侵染水稻時(shí),這兩類蛋白發(fā)生了變化,參與了水稻拮抗稻瘟菌的過程。在水稻受稻瘟菌侵染不同時(shí)間段表達(dá)差異的蛋白中,發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制劑含量顯著上升。定量PCR分析結(jié)果表明,編碼胰蛋白酶抑制劑基因在mRNA水平也顯著上升。胰蛋白酶抑制劑是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì),該蛋白能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合,抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶。因此它具有防止體內(nèi)不必要的蛋白降解,調(diào)節(jié)蛋白代謝及調(diào)節(jié)各種蛋白酶生理活性的功能。很多植物的胰蛋白酶抑制劑還具有抑制某些病原微生物及某些昆蟲體內(nèi)蛋白酶的作用,是植物體的一種自然防御體。有趣的是我們?cè)诤Y選差異表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí),發(fā)現(xiàn)一個(gè)putative dioscorin的蛋白,dioscorin為山藥儲(chǔ)藏蛋白。有研究表明,該蛋白有胰蛋白酶抑制劑活性,在我們鑒定的結(jié)果中也顯示該蛋白在水稻遭受稻瘟菌侵染時(shí),表達(dá)量顯著提升,與胰蛋白酶抑制劑的趨勢(shì)是一致的。研究還表明,與光合作用密切相關(guān)的蛋白,如Rubisco的大亞基、Rubisco subunit binding-protein alpha subunit等,在水稻遭受稻瘟菌侵染時(shí)表達(dá)量急劇下降,而與能量代謝相關(guān)的蛋白,如 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain,則在水稻遭受稻瘟菌侵染時(shí)表達(dá)量上調(diào)。2)在不同抗性水稻對(duì)稻瘟菌侵染脅迫應(yīng)答的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,我們對(duì)提取的稻瘟菌(Guy11)侵染24小時(shí)的抗稻瘟菌水稻(谷梅2號(hào))和不抗稻瘟菌水稻(黑谷)的葉片蛋白進(jìn)行定量、酶解及標(biāo)記處理,再根據(jù)肽段特征,將復(fù)雜肽段進(jìn)行SCX柱的初級(jí)分離,最后通過LC-MS/MS高通量質(zhì)譜鑒定平臺(tái)(ABSECXTripleTOFTM4600)進(jìn)行圖譜采集。通過 ProteinPilot4.5 軟件(ABSCIEX,FosterCity)針對(duì) Oryzasativa 蛋白序列進(jìn)行搜索。在FDR為1.0%時(shí),取2個(gè)及2個(gè)以上肽段支持的蛋白進(jìn)行分析。兩次重復(fù)分別鑒定到1,196和1,180個(gè)蛋白。將ratio值大于1.2的標(biāo)為上調(diào),小于0.8的標(biāo)為下調(diào),去除只有一次鑒定到的且趨勢(shì)不一致的蛋白,在抗性水稻種得到上調(diào)表達(dá)的蛋白220個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白240個(gè)。對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析、GO分類和KEGG-pathway分析,結(jié)果表明,這些差異表達(dá)蛋白共在81個(gè)通路中起著關(guān)鍵作用,參與較多的為糖異生/糖酵解途徑。進(jìn)一步將差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分泌蛋白分析,發(fā)現(xiàn)其中68個(gè)蛋白具有信號(hào)肽,可能為分泌蛋白。進(jìn)行GO enrichment分析時(shí),發(fā)現(xiàn)在光合作用、羧酸代謝過程,葉綠體組成等11個(gè)分類中有富集;我們還將這些蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析,通過string在線分析發(fā)現(xiàn),有385個(gè)功能被String數(shù)據(jù)庫收錄,這385個(gè)蛋白存在相互作用,有兩類蛋白發(fā)生聚類現(xiàn)象,對(duì)這些蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這兩類蛋白分別為:一類為能量代謝相關(guān)蛋白,另一類為核糖體相關(guān)蛋白。這與前面GO enrichment分析的結(jié)果是一致的,不同抗性的水稻在能量代謝和轉(zhuǎn)錄合成存在差異,深入研究這些差異功能,為闡明水稻抗稻瘟菌的分子機(jī)制做出貢獻(xiàn)。在研究內(nèi)容1)中我們發(fā)現(xiàn),抗稻瘟菌谷梅2號(hào)在遭受稻瘟菌侵染時(shí),胰蛋白酶抑制劑的表達(dá)顯著提升,在質(zhì)譜分析結(jié)果和定量PCR結(jié)果一致。在不同抗性水稻對(duì)稻瘟菌侵染脅迫應(yīng)答機(jī)制研究中,我們發(fā)現(xiàn)抗稻瘟菌株水稻在遭遇稻瘟菌侵染時(shí),胰蛋白酶抑制劑的表達(dá)量比不抗稻瘟菌株(黑谷)顯著提升,這一結(jié)果與Peng等在番茄葉片遭受致病疫霉時(shí)結(jié)果是一致的。根據(jù)本研究的結(jié)果,我們認(rèn)為稻瘟菌在侵染水稻時(shí),可能需要大量水解蛋白以提供能量,水稻為了拮抗稻瘟菌的侵入,高表達(dá)胰蛋白酶抑制劑,從而抑制胰蛋白酶的活性,而具有胰蛋白酶抑制劑活性dioscorin(山藥儲(chǔ)藏蛋白)也急劇提升,從而達(dá)到抑制胰蛋白酶的活性,最終達(dá)到拮抗稻瘟菌的侵染。光合代謝相關(guān)的蛋白 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit表達(dá)在抗稻瘟菌株中比感染株中顯著下調(diào),且兩個(gè)蛋白在抗稻瘟菌株中比感染株中顯著下調(diào);由此,我們推測(cè),稻瘟菌侵染水稻,抗稻瘟菌株水稻通過下調(diào)表達(dá) Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit,從而降低抗稻瘟菌水稻葉片的光合作用,拮抗稻瘟菌的侵入。能量代謝相關(guān)蛋白 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain 在不同抗性水稻遭遇稻瘟菌侵染下,ATP synthase CFI beta subunit有限上調(diào),而ATP synthase CF1 alpha chain基本沒有變化。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.41
【圖文】：

ＳＡＢＰｓ”復(fù)合體，接著將信息傳遞給胞內(nèi)第二信使如比０２等，信號(hào)會(huì)通過自我反饋機(jī)制放逡逑大，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)超敏反應(yīng)（ＨＲ），同時(shí)引起胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄逡逑因子的活化與互作，最終誘導(dǎo)ＰＲ基因表達(dá)及系統(tǒng)獲得性抗性的產(chǎn)生（圖１．２）。逡逑邐邐邋ＳＡＷ＊逡逑Ｈ；Ｏｊ邋Ｈｉ0＞邋Ｗ逡逑，邐￥ａｂ！＾邐Ｉ逡逑７邐灥：抗試 ｖ＇老＇逡逑Ｉ邐ＨＳｖＪＭｋ／ＳＨ邐ＨＳ邋／邋ＳＨ逡逑ｍ邋ｈｖＷｓｈ邋yU逡逑：？＇廔，３＾逡逑１邋ＰＯ邋ｃｉｃｍｃｎＴＴ邋｛邋ｉ？－ｉ邋｜邐｜邋Ｗ邋ｂｏｘ邋｜邐［邐＾邋ＰＢ邋ｅｌｅｍｅｎｔ邋｜邐１邋ａｓ－ｉ邋＼邐｜邋Ｗ－ｂｏｘ邋１邐１邐＼逡逑￣：＝－＾ｘ邋＾邋—邋－１—逡逑ｌ邐，＿＿＿．逡逑、＾邋［邋ＰＢ邋ｅｌｅｒｗＣＴｔ邋｜邋［邋ａ＾ｌ邋１邐［邋Ｗ－ｂｏｘ邋１邋１邐｜逡逑圖１．２水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑示意圖，圖片引自周瑩等的論文（周瑩ｅｔａｌ．，２００７）。逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＳＡ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ（周堂邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）．逡逑９逡逑

技術(shù)的第一步。質(zhì)譜技術(shù)中常應(yīng)用到的電離方式有：電噴霧離子源（ＥＳＩ）、大氣壓化學(xué)電逡逑離源（ＡＰＣＩ）、基質(zhì)輔助激光解析電離（ＭＡＬＤＩ）和大氣壓光電離源（ＡＰＰＩ）。檢測(cè)生物逡逑大分子的生物質(zhì)譜，主要應(yīng)用到ＥＳＩ和ＭＡＬＤＩ離子源軟電離技術(shù)（圖１．３）。電噴霧離子逡逑源（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ邋Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＥＳＩ）與液相色譜聯(lián)用（Ｐａｉｋｅｔａｌ．，邋２０１２），液體在色譜分離后經(jīng)逡逑噴針噴出處施加高電壓，產(chǎn)生高電場，輔助氮?dú)�，使流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，逡逑細(xì)小液滴進(jìn)一步去溶劑后實(shí)現(xiàn)離子化，形成大量帶一個(gè)電荷或多個(gè)電荷的離子，即庫倫爆逡逑炸，使分析物以氣相形式進(jìn)入質(zhì)量檢測(cè)器。由于ＥＳＩ源產(chǎn)生的為多電荷離子，使質(zhì)荷比降逡逑低，大大擴(kuò)展了生物大分子的檢測(cè)范圍；基質(zhì)輔助激光解吸電離（Ｍａｔｒｉｘ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ邋Ｌａｓｅｒ逡逑Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，邋ＭＡＬＤＩ）邋（Ｍａｒｇｕｅｒａｔｅｔａｌ．，２０１２）技術(shù)是將待測(cè)樣品與基質(zhì)混合，樣逡逑品均勻的分散在基質(zhì)中并形成結(jié)晶，激光作用于混合有樣品的晶體，化學(xué)基質(zhì)吸收光子被逡逑激活

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2715117