【摘要】：維持生物體正常生命活動的生化反應有很多種,其中氧化還原反應是最為基礎和重要的反應,催化該反應高效進行的酶類統(tǒng)稱為氧化還原酶。氧化還原酶在生物體內具有多種生理功能,包括通過催化反應為機體提供能量、清除多余有害物質、活化大分子物質等。根據(jù)不同的氨基酸結構和涉及在不同生理活動中的活性,可以將氧化還原酶劃分為很多種類型,其中葡萄糖氧化酶與過氧化物酶均是廣泛存在于植物、動物與微生物體內的,具有抗氧化功能的氧化還原酶。葡萄糖氧化酶(GOX)是一種需氧脫氫酶,具有對β-D-吡喃葡萄糖特異性識別的特點,其功能是作為抗氧化劑降低生物體內的氧濃度,維持生物的正常生理活動;為厭氧菌創(chuàng)造有益環(huán)境,抑制有害菌的生長等。過氧化物酶(POD)是抗氧化酶系統(tǒng)主要組成酶中的一員,其功能是清除生物體內多余的活性氧,防止生物體內由于活性氧過多而引起一系列的氧化損傷,如破壞大分子物質結構、酶失活、脂質過氧化等。黏蟲Mythimna separata是我國糧食作物上的重大農業(yè)害蟲之一,具有暴食性和季節(jié)性長距離遷飛等為害特征,嚴重威脅糧食生產安全。其發(fā)生危害有以下幾個特點:發(fā)生范圍廣,危害世代多;危害作物的種類和數(shù)量多;暴發(fā)性明顯,可產生嚴重的產量損失;發(fā)生危害歷史長等。目前對于黏蟲GOX與POD基因的研究仍處于初級階段,根據(jù)GOX與POD參與的氧化還原作用機制以及已知的昆蟲GOX與POD的相關研究,猜想這兩種酶參與的抗氧化酶系統(tǒng)是否與昆蟲的消化作用、抑菌作用及受到逆境產生的保護性作用有關,進而可以利用RNAi技術沉默基因,使其功能受到影響,抑制昆蟲的生理代謝活動從而達到利用生物技術防治害蟲的目的。本試驗以黏蟲為供試材料,克隆獲得兩條全新的黏蟲葡萄糖氧化酶基因MsGOX和過氧化物酶基因MsPOD的cDNA序列;分別對其核苷酸序列與氨基酸序列進行分析;研究在不同組織與不同齡期中兩種基因時空表達水平的差異性;對黏蟲進行不同濃度葡萄糖誘導處理和饑餓與復喂處理來探究MsGOX基因在昆蟲取食方面發(fā)揮的作用;對黏蟲進行不同時間不同溫度的處理,探究MsPOD基因在受到極端溫度誘導時產生的昆蟲保護性作用;利用RNAi技術探究MsGOX基因沉默后對黏蟲生長發(fā)育造成的影響,探究MsGOX基因沉默后對該基因抑菌作用的影響以及對蘇云金芽孢桿菌侵染增效的作用,為利用該基因進行分子設計來防治黏蟲奠定理論基礎。主要試驗結果總結如下:1.克隆獲得一條新的黏蟲GOX基因cDNA序列,該基因命名為MsGOX,基因登錄號為KY348779。cDNA序列全長2187 bp,包含1個長度為1821 bp的開放閱讀框,編碼含有606個氨基酸的多肽,其分子量為66.4 ku,等電點為4.79。氨基酸序列分析顯示該基因編碼的氨基酸屬于GMC家族,包括兩個保守的蛋白結構域GMC_oxred_N和GMC_oxred_C,氨基酸序列與鱗翅目夜蛾科其他昆蟲氨基酸序列親緣關系較近,與棉鈴蟲、甜菜夜蛾、谷實夜蛾和苜蓿夜蛾的一致性較高,達85%以上�？寺～@得一條新的黏蟲POD基因cDNA序列,該基因命名為MsPOD,基因登錄號MH606240。cDNA序列全長2433 bp,包含1個長度為2061 bp的開放閱讀框,編碼686個氨基酸組成的多肽,其分子量為76.1 ku,等電點為5.68。氨基酸序列分析顯示該基因編碼的氨基酸具有一個HPXs細胞粘附蛋白結構域,屬于過氧化物酶一環(huán)氧酶超家族,氨基酸序列比對顯示,MsPOD的氨基酸序列與鱗翅目夜蛾科其他昆蟲氨基酸序列親緣關系較近,其中與棉鈴蟲POD氨基酸序列同源性最高,為92%。2.探究MsGOX基因與MsPOD基因時空表達差異,分析在不同發(fā)育階段與不同組織中不同基因在蟲體內表達水平的變化情況。經試驗及分析發(fā)現(xiàn)MsGOX基因在黏蟲不同發(fā)育階段與檢測的不同組織中均有表達,其中在4齡時期和唾腺中表達量最高,在1齡時期和前腸中表達量最低。MsPOD基因在不同發(fā)育階段和不同組織中也均有表達,在蛹期和唾腺中表達量最高,在1齡時期和前腸中表達量最低。3.探究MsGOX基因與昆蟲取食作用的關系。對黏蟲進行4種不同濃度葡萄糖溶液的處理,結果顯示4種濃度的葡萄糖溶液均能誘導MsGOX基因的表達水平,并且越高濃度的葡萄糖溶液對MsGOX基因的表達水平影響越大,在葡萄糖濃度為10%時,該基因的表達水平達到最高;對黏蟲進行饑餓處理,結果表明隨著饑餓時間的增加,MsGOX基因的表達水平呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,在處理24 h時表達水平達到最高;同時饑餓處理的黏蟲進行復喂處理,結果表明MsGOX的表達水平有逐漸升高的趨勢。探究MsPOD基因受極端溫度誘導產生的昆蟲保護性作用。對黏蟲進行不同溫度梯度與不同時間的處理,結果表明經溫度梯度誘導后,MsPOD基因在不同時間點的表達水平具有顯著差異,在35℃高溫處理12 h后表達水平達到最高。4.探究MsGOX基因被干擾后對黏蟲生長發(fā)育的影響。結果顯示黏蟲的體重、體長與消化系數(shù)均受到影響,在處理12 h后有明顯的抑制作用。探究MsGOX基因被干擾后對該基因抑菌作用的影響。結果顯示注射dsGOX的處理組黏蟲中腸菌懸液制作的平板菌落數(shù)量大于注射dsEGFP的對照組黏蟲中腸菌懸液制作的平板菌落數(shù)量,表明MsGOX基因的抑菌作用受到一定程度的抑制。探究MsGOX基因被干擾后對蘇云金芽孢桿菌侵染黏蟲的增效作用。結果顯示進行蘇云金芽孢桿菌侵染后,注射了dsGOX的處理組死亡率較注射了dsEGFP的對照組相比有所升高,說明黏蟲抵抗蘇云金芽孢桿菌的侵染能力在進行基因沉默后有所降低,對Bt菌有一定的增效作用。以上試驗結果證明利用RNAi方法成功抑制了MsGOX基因的表達,并且發(fā)現(xiàn)MsGOX基因可能在黏蟲的中腸消化中起到某種作用。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S433.4
【圖文】：

東北農業(yè)大學農學碩士學位論文右，具有很好的穩(wěn)定性；最適溫度集中在 30-60 ℃；GOX 在固體酶制劑的狀態(tài)下于 0 ℃可穩(wěn)定存在 2 年左右[16-17]。1.1.2 GOX 的作用機理GOX 通常與 CAT 以及輔基 FAD 結合形成氧化還原酶系統(tǒng)，進行催化氧化作用[18]。作用機理可以簡單的概括為：β-D-葡萄糖分子通過輔酶 EFAD的作用生成 -D-葡萄糖酸內酯，輔酶 EFAD得到 β-D-葡萄糖分子中的氫原子后被還原為 EFADH2，之后 -D-葡萄糖酸內酯酸度緩釋水解成 D-葡萄糖酸，同時 EFADH2再氧化為 EFAD，并生成 H2O2。由此反應過程可以看出，GOX 催化的反應產物同時也是生物體代謝反應必不可少的底物，并伴隨著反應過程中的能量傳遞。催化反應過程如下（圖 1-1）。

前 言有一定的作用。Park 等[70]克隆了 10 條甜菜夜蛾 POD 基因（SePOX A-J），并研究了該系列基因在昆蟲細胞免疫反應中的作用。見煜坤[71]克隆了褐飛虱 Nilaparvata lugens 過氧化物酶基因，研究表明該基因在褐飛虱生命活動及生理代謝中起到重要作用，并且可能與褐飛虱的遺傳變異有關。1.4.2 昆蟲 POD 家族及相關功能Zamock 等[72]根據(jù)蛋白結構與酶活性的不同，將 HPXs 分為四個超家族（圖 1-2）。

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