發(fā)布時(shí)間：2020-06-04 10:37

【摘要】：煙草野火病和煙草角斑病是煙草生產(chǎn)過(guò)程中兩種主要的細(xì)菌性病害,侵染煙草后會(huì)造成煙草葉片穿孔,變褐,烤后葉片易碎,工業(yè)使用性降低,對(duì)于煙農(nóng)的增產(chǎn)增收造成嚴(yán)重的影響。因此,建立一套煙草野火病和角斑病的精準(zhǔn)可視化檢測(cè)體系,能夠在煙草葉片中未顯癥之前進(jìn)行檢測(cè)和預(yù)警,可為病害的防治提供依據(jù),具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated Isothermal Amplification,簡(jiǎn)稱LAMP),具有檢測(cè)速度快、對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求低、特異性高、靈敏性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué),動(dòng)植物病害檢測(cè),轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域。本試驗(yàn)將LAMP技術(shù)用于煙草野火病和煙草角斑病的檢測(cè),利用全基因組比對(duì)的手段,分別獲得了1組煙草野火病菌和角斑病菌的LAMP特異性檢測(cè)引物,在此基礎(chǔ)上,建立和優(yōu)化了兩種病原的LAMP快速檢測(cè)方法,并進(jìn)行了田間應(yīng)用,為病害發(fā)生預(yù)報(bào)提供了一種新的技術(shù)和手段。主要研究結(jié)果如下:(1)分離與純化了煙草野火病菌和煙草角斑病菌。分別對(duì)來(lái)自于不同地區(qū)的煙草病葉標(biāo)本進(jìn)行了病菌的分離、純化和鑒定,最終獲得純化的煙草野火病菌與煙草角斑病菌。(2)對(duì)煙草野火病菌進(jìn)行普通PCR引物設(shè)計(jì),最終得到煙草野火病的特異性引物40429,并驗(yàn)證其特異性。試驗(yàn)利用mavue2.3.1軟件進(jìn)行全基因組的比對(duì),根據(jù)篩選出來(lái)的特異性區(qū)段,利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。將設(shè)計(jì)的引物與對(duì)照菌株進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增對(duì)照,最終獲得了一組特異性引物。(3)試驗(yàn)分別獲得了一組煙草野火病菌和一組煙草角斑病菌的LAMP引物。根據(jù)普通PCR特異性引物對(duì)應(yīng)的特異性區(qū)段,利用LAMP在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站LAMP primer designing software PrimerExplorer V5,設(shè)計(jì)了煙草野火病菌LAMP檢測(cè)引物并進(jìn)行了驗(yàn)證;由于缺少煙草角斑病菌的全基因組數(shù)據(jù),試驗(yàn)通過(guò)利用煙草野火病菌的普通PCR引物對(duì)于煙草角斑病菌進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,并與煙草野火病菌的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果相比對(duì),最終獲得了煙草野火病與煙草角斑病存在的差異片段。基于此,設(shè)計(jì)了煙草角斑病菌的特異性引物378/379/380/381,并驗(yàn)證了引物的特異性。(4)建立并優(yōu)化了煙草野火病與煙草角斑病LMAP快速檢測(cè)體系�；贚AMP檢測(cè)體系中參與反應(yīng)的反應(yīng)物,對(duì)BST DNA Polymerase的使用量,dNTP的使用量,Mg~(2+)的使用濃度,甜菜堿的使用濃度,內(nèi)外引物的配比,反應(yīng)時(shí)長(zhǎng),反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定了最優(yōu)化的田間LAMP檢測(cè)工作濃度。(5)將建立的煙草野火病與煙草角斑病LAMP檢測(cè)體系與田間應(yīng)用相結(jié)合,驗(yàn)證了檢測(cè)體系的可靠性。利用田間采樣的疑似染病葉片及健康葉片作為對(duì)照,通過(guò)和普通PCR、熒光定量PCR做對(duì)比,試驗(yàn)最終確定了LAMP檢測(cè)體系的可靠性以及靈敏性。
【圖文】：

1 2 3 4 M 5 6 7 8析斑病菌的分離與鑒定培養(yǎng)平板上取混合菌液進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，如圖 1 所示，以煙草野火，其能夠在引物 421/422 的作用下產(chǎn)生大小為 423 bp 大小的目的 的作用下產(chǎn)生大小為 1263 bp 大小的目的條帶；而含有煙草角斑6-8）在引物 421/422 的作用下產(chǎn)生 423 bp 大小的目的條帶，但下未產(chǎn)生 1263 bp 大小的條帶。說(shuō)明混合菌液中含有煙草角斑病菌。

圖 2 煙草角斑病單斑 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product of P. syringae pv. angulata single spot為煙草野火病菌；2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 模板為疑似煙草角斑病菌單斑；1-6 使用引物為引物 421/4使用引物為引物 423/424；M 為 DL2000 marker,7 template is P. syringae pv. tabaci. 2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 template is suspected single spot of P. syringaeangulata. 1-6 using primer is 421/422. 7-12 using primer is 423/424. M is DL2000 marker.草角斑病菌的接種驗(yàn)證化后培養(yǎng)的煙草角斑病菌接種到煙草葉片后，7 天后觀察發(fā)病情況，如圖后，，煙草葉片已經(jīng)發(fā)病，葉片有不規(guī)則的角狀病斑，根據(jù)煙草角斑病的田確定病斑為煙草角斑病病斑，證明純化的病菌即為煙草角斑病菌。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.72

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3 張世s

本文編號(hào)：2696256