【摘要】：細(xì)胞自噬(autophagy)是真核生物對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行自身降解的重要生物學(xué)過(guò)程,此過(guò)程中損壞的蛋白或不需要的細(xì)胞器被雙層膜的自噬小泡包裹后送入溶酶體(動(dòng)物)或液泡(植物和酵母)中進(jìn)行降解并循環(huán)利用。細(xì)胞自噬參與多種生理生化反應(yīng),包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、饑餓、細(xì)菌或病毒感染等,其中病毒感染與自噬關(guān)系的研究對(duì)于更好的理解宿主與病毒互作機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義。家蠶,作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),由于被長(zhǎng)期馴化飼養(yǎng)逃避了自然環(huán)境的選擇,是研究病毒感染與宿主互作的良好素材。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)屬于桿狀病毒屬,是一類(lèi)具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒。病毒感染宿主的過(guò)程中調(diào)控宿主多種機(jī)制以利于自身增殖復(fù)制,同時(shí)伴隨著各種宿主應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。近年來(lái),隨著對(duì)BmNPV感染機(jī)制研究的深入,部分宿主抗性機(jī)制得到解析,但是病毒與宿主的互作網(wǎng)絡(luò)仍然不清楚。本研究利用家蠶與BmNPV這一模型,發(fā)現(xiàn)了BmNPV感染能影響家蠶細(xì)胞自噬;隨后,在細(xì)胞和個(gè)體水平分別利用過(guò)表達(dá)和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù),證實(shí)了自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥竞蛷?fù)制增殖的影響;最后,通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜分析探究了自噬相關(guān)基因影響病毒感染的分子機(jī)制。通過(guò)本研究,可為揭示家蠶細(xì)胞自噬與BmNPV感染的互作機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。論文取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.BmNPV感染對(duì)家蠶細(xì)胞自噬的影響本研究通過(guò)多種經(jīng)典的自噬檢測(cè)方法證實(shí)了BmNPV感染可以誘導(dǎo)家蠶卵巢細(xì)胞系BmN-SWU1細(xì)胞發(fā)生自噬。首先通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到BmNPV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)大量的雙層膜自噬小泡,與饑餓誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照相似,而正常培養(yǎng)的細(xì)胞中則幾乎不存在這種囊泡結(jié)構(gòu)。通過(guò)免疫熒光觀察ATG8-GFP(自噬體膜標(biāo)記蛋白)綠色熒光聚點(diǎn)的情況,發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞的早期(6h),細(xì)胞中ATG8-GFP綠色熒光聚點(diǎn)明顯增加,而在感染晚期又逐漸減少;統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明感染早期含有綠色熒光聚點(diǎn)的細(xì)胞百分比以及單個(gè)細(xì)胞中熒光聚點(diǎn)的數(shù)目都有明顯增加的趨勢(shì)。免疫印跡檢測(cè)ATG8向ATG8-PE(具有膜結(jié)合能力的ATG8蛋白)的轉(zhuǎn)化在病毒感染早期顯著加強(qiáng);ATG8-PE/Tubulin的灰度計(jì)算和倍率分析也顯示同樣的結(jié)果。自噬體的出現(xiàn)并不能表明其最終會(huì)與溶酶體融合發(fā)生降解而形成完整的自噬流,因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了自噬流的發(fā)生情況。我們構(gòu)建了ATG8-GFP-RFP雙熒光檢測(cè)系統(tǒng),共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)病毒感染后的細(xì)胞中存在大量只發(fā)紅光而不發(fā)綠光的熒光聚點(diǎn)(即自噬溶酶體),而對(duì)照中紅色熒光則與綠色熒光完全散在重合。p62蛋白作為目前研究最清楚的選擇性自噬受體,其降解也是自噬流發(fā)生的典型標(biāo)志。通過(guò)p62蛋白的檢測(cè)和分析,結(jié)果顯示在病毒感染早期p62發(fā)生顯著的降解現(xiàn)象。以上結(jié)果表明BmNPV感染確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞發(fā)生完整的自噬。2.自噬相關(guān)基因?qū)mNPV感染家蠶細(xì)胞的影響自噬相關(guān)基因(Autophagy-related genes,Atgs)是一類(lèi)保守的在自噬通路中起關(guān)鍵作用的基因。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和分析,我們發(fā)現(xiàn)家蠶中目前鑒定的15個(gè)Atgs(Atg1-9、Atg11-14、Atg16和Atg18)基因均具有其保守的自噬基因相關(guān)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有的自噬相關(guān)基因的表達(dá)在病毒感染的過(guò)程中都出現(xiàn)了明顯的波動(dòng),其中大部分呈現(xiàn)早期上調(diào)而后下降的趨勢(shì),與病毒誘導(dǎo)自噬發(fā)生的趨勢(shì)一致。隨后通過(guò)過(guò)表達(dá)單個(gè)Atg基因檢測(cè)下游Atg8和Atg12基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)單個(gè)Atg基因可引起下游Atg8和Atg12基因表達(dá)量的增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)單個(gè)Atg基因時(shí)病毒ie-1基因(病毒立即早期基因)表達(dá)顯著上調(diào),而敲除單個(gè)Atg基因時(shí)病毒ie-1基因則顯著下調(diào);進(jìn)一步篩選部分Atgs基因的過(guò)表達(dá)和敲除樣品,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)vp39(病毒晚期基因)和p10(病毒極晚期基因)的表達(dá)水平也出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)上調(diào)而敲除下調(diào)的趨勢(shì)。以上結(jié)果證明單個(gè)自噬相關(guān)基因的變化即可影響病毒關(guān)鍵基因的表達(dá)。通過(guò)篩選自噬通路上不同階段行使功能的自噬相關(guān)基因,結(jié)合前期結(jié)果中對(duì)病毒感染影響的顯著性以及對(duì)自噬本身的影響效果,我們最終選擇Atg7、Atg9和Atg13作為后續(xù)研究的關(guān)鍵基因。3.自噬相關(guān)基因?qū)mNPV感染家蠶個(gè)體的影響為了確定自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥舅拗鱾�(gè)體的影響,通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因家蠶并對(duì)其感染病毒的情況進(jìn)行分析。首先,我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體。通過(guò)轉(zhuǎn)基因注射和篩選成功獲得三個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)品系,命名為BmAtg7-OE,BmAtg9-OE和BmAtg13-OE,定量檢測(cè)表明轉(zhuǎn)基因品系均可顯著高量表達(dá)靶標(biāo)基因。另外還獲得了sgAtg13-DsRed品系,通過(guò)與本實(shí)驗(yàn)室先前保存的Cas9-EGFP品系雜交,篩選獲得了雙光的敲除品系,命名為BmAtg13-KO,提取基因組T克隆測(cè)序表明敲除效率高達(dá)70%。四齡起大造和轉(zhuǎn)基因品系同時(shí)添食10~6病毒粒子,通過(guò)致死率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)家蠶品系具有顯著的較高致死率,而B(niǎo)mAtg13-KO敲除品系則表現(xiàn)出一定的抗性。病毒基因組拷貝數(shù)分析和病毒關(guān)鍵基因的表達(dá)也呈現(xiàn)出與感染后致死率統(tǒng)計(jì)一致的結(jié)果。以上結(jié)果充分說(shuō)明自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥緜�(gè)體的過(guò)程具有顯著的影響。4.BmAtg13影響B(tài)mNPV感染宿主效率的機(jī)制研究為了探究自噬相關(guān)基因影響病毒感染的分子機(jī)制,根據(jù)前期研究數(shù)據(jù)我們將Atg13基因(自噬起始復(fù)合物ULK1的重要成員之一)作為進(jìn)一步機(jī)制研究的靶基因。首先我們通過(guò)序列比對(duì),保守結(jié)構(gòu)域分子模型預(yù)測(cè)以及進(jìn)化樹(shù)分析確認(rèn)了Atg13基因的保守性。然后利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析釣取到ATG13互作候選蛋白,包括家蠶蛋白polyubiquitin、ATG7、Hsp70以及大量核糖體蛋白和病毒蛋白Orf5、Orf10與Bro-B。免疫熒光共定位和免疫共沉淀的驗(yàn)證,確認(rèn)了ATG13與Bro-B,ATG13與ATG7的互作關(guān)系。Bro-B是桿狀病毒延遲早期蛋白,具有核酸結(jié)合活性,可以影響宿主蛋白的合成而有利于自身的感染。ATG13與Bro-B的互作可能涉及宿主與病毒的相互調(diào)控。ATG7是自噬兩個(gè)類(lèi)泛素共軛系統(tǒng)的關(guān)鍵修飾酶,對(duì)自噬體的成膜和延伸至關(guān)重要。ATG13與ATG7的互作可能與ATG13作為自噬上游起始復(fù)合物一員調(diào)控自噬發(fā)生的功能有關(guān)。截短分析Bro-B與ATG13的互作結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)ATG13的N端HORMA結(jié)構(gòu)域僅與Bro-B的N端可以發(fā)生共定位,而ATG13的C端無(wú)結(jié)構(gòu)域序列則與Bro-B的N和C端均可發(fā)生共定位。最后通過(guò)檢測(cè)兩者的相互調(diào)控關(guān)系發(fā)現(xiàn)BmAtg13處于Bro-B的上游,BmAtg13過(guò)表達(dá)抑制Bro-B的表達(dá),而敲除則促進(jìn)Bro-B的表達(dá)。上述研究證實(shí)了BmAtg13與病毒之間存在的博弈,為深入研究自噬與病毒互作機(jī)制提供了理論參考和方向。
【圖文】：

圖 1.1 細(xì)胞自噬的發(fā)生[15]細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，自噬體的形成主要經(jīng)歷以下過(guò)程：起始、延伸、關(guān)閉、成Fig. 1.1 The occurrence of autophagy[15]l stimulus induces autophagy, the formation of autophagic is mainly through theion, closure, murturation and degradation.關(guān)基因的功能和調(diào)控機(jī)制研究65 年，科學(xué)家就通過(guò)電子顯微鏡觀察到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞

圖 1.2 自噬通路的分子機(jī)制[19]續(xù)抑制自噬的誘導(dǎo)中起著核心作用；b，吞噬泡的形成是由 III 型 PI3K 復(fù)合物介導(dǎo)的合涉及兩個(gè)類(lèi)泛素共軛系統(tǒng)；d，在各種正向和負(fù)向調(diào)控因子的調(diào)節(jié)下，完整的自噬熟的自噬溶酶體。Fig 1.2 The molecular mechanism of autophagy pathway[19]. a central role in constitutively suppressing induction of autophagy; b,Formation of the pha class III PI3K complex; c, Growth and closure of the autophagosome membrane; d, The fuses with lysosome and matures into autolysosome.，Lin 等總結(jié)介紹了哺乳動(dòng)物中在自噬發(fā)生和調(diào)控方面具有重要 1）。其中涵蓋了自噬體形成所需關(guān)鍵基因的功能分析[21-37]，即噬相關(guān)基因，還包括了自噬調(diào)控的關(guān)鍵基因以及其調(diào)控機(jī)制的總 和 Beclin-1 兩大蛋白的調(diào)控）[38-40]，具有重要的參考價(jià)值。m絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，，是整合生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、能量狀態(tài)以
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S884.51

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本文編號(hào)：2695316