【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是重要的泌絲經(jīng)濟(jì)昆蟲。絲腺是家蠶幼蟲特有的泌絲器官,絲蛋白大量合成的前提是絲腺細(xì)胞進(jìn)行核內(nèi)周期(endocycle)。核內(nèi)周期,也稱為核內(nèi)復(fù)制周期,是正常有絲分裂細(xì)胞周期的變異形式,即細(xì)胞只進(jìn)行DNA復(fù)制而不發(fā)生胞質(zhì)分裂,從而形成了多倍體細(xì)胞。家蠶絲腺細(xì)胞僅在胚胎期發(fā)生約10次有絲分裂,形成了包含前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺約1080個(gè)細(xì)胞。自此之后,絲腺細(xì)胞進(jìn)入核內(nèi)周期,只進(jìn)行DNA的合成和細(xì)胞體積的增大。在幼蟲期,絲腺細(xì)胞經(jīng)歷持續(xù)的17~19輪核內(nèi)周期,使得DNA含量達(dá)到正常二倍體細(xì)胞的約40萬(wàn)倍,這為吐絲期絲蛋白的大規(guī)模合成奠定了遺傳基礎(chǔ)。果蠅和小鼠中核內(nèi)周期的研究表明,核內(nèi)周期的運(yùn)轉(zhuǎn)是由細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的周期性振蕩驅(qū)動(dòng)的。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)是CDK的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子,它能與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和CDK結(jié)合并抑制CDK的激酶活性。與自然界其它進(jìn)行核內(nèi)周期的細(xì)胞相比,家蠶絲腺細(xì)胞發(fā)生核內(nèi)復(fù)制的時(shí)間跨度更長(zhǎng),DNA復(fù)制效率更高效,是研究核內(nèi)周期的理想材料,闡明絲腺細(xì)胞核內(nèi)周期的調(diào)控機(jī)制,可為完善家蠶細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制提供重要線索,也可為絲腺遺傳改良提供重要的理論依據(jù)。本研究對(duì)家蠶CKI進(jìn)行了克隆和鑒定,并分析了該基因參與調(diào)控絲腺核內(nèi)周期的作用機(jī)制,為家蠶絲腺細(xì)胞核內(nèi)周期機(jī)制的解析和家蠶絲腺遺傳改良提供了有利依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:1.BmCKI基因的鑒定及特征分析家蠶基因組中僅存在一個(gè)Cip/Kip家族同源基因,將該基因命名為BmCKI。BmCKI有兩個(gè)剪切體,分別命名為BmCKI-L和BmCKI-S。這兩個(gè)剪切體具有不同的5’非編碼區(qū)(5’untranslated region,5’UTR),BmCKI-S從第二個(gè)外顯子處的起始密碼子進(jìn)行翻譯。BmCKI-L的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)全長(zhǎng)654 bp,編碼217個(gè)氨基酸(amino acid,aa),而BmCKI-S的CDS長(zhǎng)度為579 bp,編碼192個(gè)氨基酸,兩者的CDS僅在5’端相差75 bp。序列分析顯示,BmCKI-L和BmCKI-S存在Cip/Kip家族保守的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含cyclin結(jié)合位點(diǎn)和CDK結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示,家蠶BmCKI蛋白與果蠅的同源蛋白聚在一支,兩者同源性最高。免疫熒光分析BmCKI-L和BmCKI-S的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示兩者均定位于細(xì)胞核。為了鑒定BmCKI的核定位信號(hào),我們構(gòu)建了一系列BmCKI-L的截短突變,并通過免疫熒光分析其定位情況。結(jié)果表明,181-210 aa區(qū)域是BmCKI-L核定位序列所在之處,該區(qū)域存在一個(gè)非典型的二元核定位信號(hào),該核定位信號(hào)前后由兩簇基本氨基酸組成,中間由16 aa連接,連接區(qū)域富含弱堿性的組氨酸。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析了BmCKI-L和BmCKI-S的組織表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)BmCKI-L在表皮和卵巢的表達(dá)量較高,而在精巢的表達(dá)量較低;BmCKI-S在中腸的表達(dá)量比較高,而在絲腺的表達(dá)量最低,表明BmCKI-L和BmCKI-S存在不同的表達(dá)模式。2.BmCKI對(duì)家蠶細(xì)胞周期的調(diào)控為了在細(xì)胞水平上鑒定BmCKI的功能,我們首先在BmN-SWU1細(xì)胞系中,分別進(jìn)行了過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S的實(shí)驗(yàn)研究。過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S的實(shí)驗(yàn)組中,G1期細(xì)胞顯著增加,S期和G2期細(xì)胞顯著減少,表明過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期;在過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細(xì)胞中BrdU標(biāo)記率明顯下降,表明過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S抑制DNA復(fù)制;過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細(xì)胞增殖活性顯著下降,表明過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S抑制細(xì)胞增殖。同時(shí),在BmN-SWU1細(xì)胞系中,分別進(jìn)行了干涉BmCKI-L和BmCKI-S的實(shí)驗(yàn)研究。干涉BmCKI-L和BmCKI-S的實(shí)驗(yàn)組中,G2/M期細(xì)胞顯著增加,S期和G1期細(xì)胞顯著減少,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S使細(xì)胞積累于G2/M期;在干涉BmCKI-L和BmCKI-S的細(xì)胞中BrdU標(biāo)記率顯著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進(jìn)DNA復(fù)制;干涉BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細(xì)胞增殖活性顯著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進(jìn)細(xì)胞增殖。綜上表明,BmCKI-L和BmCKI-S參與細(xì)胞周期調(diào)控。為了探究BmCKI調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制,我們利用qRT-PCR分別檢測(cè)了過表達(dá)和干涉BmCKI后各周期調(diào)控因子的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E以及周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4表達(dá)量顯著下調(diào),說明過表達(dá)BmCKI-L和BmCKI-S抑制G1和S期各周期調(diào)控因子的表達(dá);干涉BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A和cyclin B以及周期蛋白依賴性激酶CDK1表達(dá)量顯著上調(diào),說明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進(jìn)G2和M期周期調(diào)控因子的表達(dá)。3.BmCKI對(duì)家蠶個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控為了在個(gè)體水平上鑒定BmCKI的功能,我們利用家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù),創(chuàng)制了全蠶過表達(dá)BmCKI-L的轉(zhuǎn)基因品系,命名為BmCKI-L-OE。對(duì)BmCKI-L-OE品系G1代的蠶卵進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)約2/3的胚胎致死,1/3的胚胎能成功孵化。相較于同齡期正常大造,BmCKI-L-OE幼蟲體型小且存在不同程度的發(fā)育遲緩,此外在飼養(yǎng)過程中BmCKI-L-OE幼蟲逐漸死亡。我們對(duì)BmCKI-L-OE品系在胚胎期和幼蟲期的存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示在家蠶中過表達(dá)BmCKI-L會(huì)引起胚胎及幼蟲致死。解剖BmCKI-L-OE品系5齡幼蟲,發(fā)現(xiàn)BmCKI-L-OE品系幼蟲多個(gè)組織的發(fā)育存在異常,比如:馬氏管萎縮;氣管分支顯著減少且長(zhǎng)度嚴(yán)重縮短;絲腺顯著變小;脂肪體很少。以上結(jié)果表明,BmCKI參與家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。4.BmCKI對(duì)家蠶絲腺核內(nèi)周期的調(diào)控為了鑒定BmCKI是否參與絲腺細(xì)胞核內(nèi)周期調(diào)控,我們利用家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù),創(chuàng)制了絲腺組織特異性過表達(dá)BmCKI-L的轉(zhuǎn)基因品系,命名為Ser1~P-BmCKI-L-OE。表型分析結(jié)果顯示Ser1~P-BmCKI-L-OE幼蟲相比于正常大造體型明顯要小,體重明顯要輕;以及其絲腺的大小、長(zhǎng)度、直徑和重量都要明顯小于大造幼蟲的,表明在家蠶絲腺組織中過表達(dá)BmCKI-L會(huì)抑制絲腺的生長(zhǎng)發(fā)育。經(jīng)濟(jì)性狀分析結(jié)果顯示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的全繭量、蛹重、繭層量相比于正常大造都顯著減輕;同時(shí),Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的繭層率相比于正常大造顯著減小。利用冷凍切片和DAPI染色檢測(cè)絲腺細(xì)胞DNA含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部絲腺的DAPI標(biāo)記量均顯著低于大造組,說明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系DNA含量比大造組少;對(duì)Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的絲腺體外進(jìn)行BrdU標(biāo)記以測(cè)定絲腺DNA復(fù)制情況,結(jié)果顯示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部絲腺BrdU標(biāo)記率均低于大造組,說明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系絲腺DNA復(fù)制相較于大造品系減弱。以上結(jié)果表明,在絲腺組織中特異性過表達(dá)BmCKI-L抑制絲腺細(xì)胞的核內(nèi)周期。5.BmCKI相互作用蛋白的鑒定及作用機(jī)制研究為了鑒定BmCKI的作用機(jī)制,我們首先通過酵母雙雜交技術(shù),以BmCKI-L蛋白為誘餌篩選到3個(gè)與BmCKI-L可能存在相互作用的蛋白,分別是BmPCNA、BmRACK1和BmSTMN。通過酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),免疫熒光共定位以及免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)這3個(gè)蛋白與BmCKI-L都具有相互作用。PCNA是DNA聚合酶的輔助因子,在DNA復(fù)制和修復(fù)中起到重要作用。RACK1是一個(gè)具有7個(gè)色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列的支架蛋白,在細(xì)胞不同區(qū)域分別結(jié)合各種蛋白,從而在許多基本生理過程中都發(fā)揮重要的作用。STMN是一種微管不穩(wěn)定蛋白,存在于胞質(zhì)中,與微管解聚有關(guān)。qRT-PCR分析這3個(gè)基因的組織表達(dá)譜,結(jié)果顯示BmPCNA基因在絲腺中特異性高表達(dá),BmSTMN基因在絲腺特異性中低表達(dá),而BmRACK1基因在各個(gè)組織中均有較高的表達(dá)。流式檢測(cè)BmPCNA過表達(dá)和干涉對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示過表達(dá)BmPCNA后,S期細(xì)胞增加,而干涉BmPCNA后,S期細(xì)胞減少。推測(cè),過表達(dá)BmPCNA抑制DNA的復(fù)制從而導(dǎo)致S期細(xì)胞減少;反之,干涉BmPCNA促進(jìn)DNA的復(fù)制從而引起S期細(xì)胞增加。qRT-PCR結(jié)果表明,BmCKI-L處于BmPCNA的上游,并抑制BmPCNA的表達(dá)。推測(cè),BmCKI-L可能通過抑制BmPCNA,調(diào)控DNA復(fù)制,從而調(diào)控細(xì)胞周期。流式結(jié)果顯示過表達(dá)BmRACK1,G1期細(xì)胞增加,G2/M期細(xì)胞減少;而干涉BmRACK1,G2/M期細(xì)胞增加,G1期細(xì)胞減少。qRT-PCR結(jié)果表明,BmRACK1可能處于BmCKI-L的上游,并促進(jìn)BmCKI-L的表達(dá)。推測(cè),過表達(dá)BmRACK1,引起B(yǎng)mCKI-L表達(dá)量上升,從而導(dǎo)致G1期細(xì)胞增多,G2/M期細(xì)胞減少;反之干涉BmRACK1,降低了BmCKI-L的表達(dá)量,使得G2/M期細(xì)胞增加,G1期細(xì)胞減少。流式結(jié)果顯示,無(wú)論過表達(dá)還是干涉BmSTMN都會(huì)引起G2/M期細(xì)胞增加,G1期細(xì)胞減少。推測(cè),持續(xù)過表達(dá)或干涉BmSTMN,都會(huì)導(dǎo)致紡錘體無(wú)法順利組裝,從而將細(xì)胞周期阻滯在M期。qRT-PCR結(jié)果顯示,BmCKI-L處于BmSTMN的上游,并抑制BmSTMN的表達(dá)。推測(cè),BmCKI-L可通過抑制BmSTMN,調(diào)控細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò),從而調(diào)控細(xì)胞周期。綜上,我們構(gòu)建了可能的BmCKI調(diào)控細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)。BmCKI可通過多種途徑參與正常有絲分裂周期和絲腺核內(nèi)周期的調(diào)控:BmCKI與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合并抑制復(fù)合物的活性,參與細(xì)胞周期調(diào)控;BmCKI通過結(jié)合并抑制BmPCNA,調(diào)控DNA復(fù)制,參與細(xì)胞周期調(diào)控;BmCKI通過結(jié)合并抑制BmSTMN,調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué),參與細(xì)胞周期調(diào)控;此外,BmRACK1影響B(tài)mCKI的表達(dá)。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述周期胞周期概述次細(xì)胞分裂期結(jié)束開始，經(jīng)過物質(zhì)積累過程，直到下一次細(xì)胞稱為一個(gè)細(xì)胞周期。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期可以人為地劃分為先：G1 期、DNA 合成期（S 期）、G2 期和細(xì)胞分裂期（M 期）（ DNA 復(fù)制的準(zhǔn)備期，主要特點(diǎn)是細(xì)胞中大量合成 DNA 復(fù)制所需類和脂質(zhì)等。S 期是細(xì)胞周期進(jìn)程中最重要的一個(gè)時(shí)期，細(xì)胞中 復(fù)制，同時(shí)也合成組蛋白及非組蛋白。G2 期是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備量合成 RNA、ATP 及一些與 M 期結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，形成的基本單位微管蛋白。M 期細(xì)胞進(jìn)行分裂，此期內(nèi)細(xì)胞形變化，染色體凝集及分離，核膜、核仁破裂及重建，紡錘體、，繼而細(xì)胞核發(fā)生分裂形成兩個(gè)子核后，胞質(zhì)一分為二，細(xì)胞完成

西南大學(xué)博士學(xué)位論文無(wú)法向 G1 期逆轉(zhuǎn)[24]。cyclin A-CDK 復(fù)合物是 S 期最主要的 cyclin-CDK 復(fù)合物，能啟動(dòng) DNA 的復(fù)制，并阻止已復(fù)制的 DNA 發(fā)生重復(fù)復(fù)制[25]。G2 期晚期形成的cyclin B-CDK 復(fù)合物在促進(jìn) G2 期向 M 期轉(zhuǎn)換的過程中起到關(guān)鍵作用，cyclinB-CDK1 復(fù)合物磷酸化組蛋白 H1、核纖層蛋白等多種蛋白，促進(jìn)染色質(zhì)凝集，核纖解聚等，從而促使細(xì)胞進(jìn)入 M 期。M 期細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上所發(fā)生的變化以及中期向后期、M 期向下一個(gè) G1 期的轉(zhuǎn)化均與 cyclin B-CDK1 復(fù)合物有關(guān)。在有絲分裂后期末，，cyclin B 在激活的 APC 作用下，經(jīng)多聚泛素化途徑被降解，cyclinB-CDK1 復(fù)合物解聚、失活，促使細(xì)胞轉(zhuǎn)向末期，此時(shí)細(xì)胞中因失去 cyclin B-CDK1的活性，磷酸化的組蛋白、核纖層蛋白等可在磷酸酶作用下發(fā)生去磷酸化，染色體又重新開始凝集、核膜也再次組裝，子代細(xì)胞核逐漸形成。后期末 cyclin B-CDK1的活性降低，也促進(jìn)了胞質(zhì)分裂的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S881.2;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 M.R.Goldsmith;F.C.Kafatos;崔立旺;;蠶體發(fā)育調(diào)節(jié)的基因(上)[J];國(guó)外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1987年01期

2 周明哲;肖清華;;五齡蠶飼育溫度對(duì)絲腺 GPT 酶、血液海藻糖酶活性的影響[J];四川蠶業(yè);1989年03期

3 鄭蘅;;為什么絲腺到五齡期特別發(fā)達(dá)[J];蠶桑通報(bào);1982年04期

4 崔為正;吳載德;徐俊良;;昆蟲保幼激素和蛻皮激素對(duì)家蠶絲腺生長(zhǎng)的影響[J];江蘇蠶業(yè);1991年02期

5 田中一行,霸井隆重三,長(zhǎng)島榮一;絹絲的構(gòu)造——關(guān)于家蠶絹絲腺的生理和遺傳[J];蠶學(xué)通訊;1994年03期

6 ;家蠶生理生化學(xué)講座(三) 第三講 絲腺[J];江蘇蠶業(yè);1986年03期

7 華剛;張堅(jiān);胡雨婷;衛(wèi)正國(guó);王軍;易軍;;雌二醇對(duì)家蠶絲腺生長(zhǎng)的影響[J];江蘇蠶業(yè);1993年01期

8 張義成,郝東田,劉增朝,孟平,許方國(guó);18種鱗翅目昆蟲絲腺及菲氏腺形態(tài)比較[J];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1997年02期

9 何忠琴,李明忠;第4脫皮期(D_2階段)4齡家蠶絹絲腺中絲素酶的純化和特性[J];國(guó)外絲綢;2005年02期

10 王宗舜,郭郛;家蠶后絲腺細(xì)胞染色質(zhì)的一些特性[J];昆蟲學(xué)報(bào);1980年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 潘敏慧;馮振月;洪開麗;田志強(qiáng);魯成;;家蠶絲腺細(xì)胞系的建立及其基因表達(dá)特征[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第六屆家蠶和柞蠶遺傳育種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 葉露鵬;錢秋杰;張玉玉;尤征英;車佳倩;宋佳;鐘伯雄;;家蠶絲腺生物反應(yīng)器中絲膠蛋白1啟動(dòng)子的分析和外源基因表達(dá)效率的輔助檢測(cè)(英文)[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第八屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2014年

3 王永峰;陳學(xué)東;王歡;王玉龍;吳成家;司馬楊虎;徐世清;;依賴caspase信號(hào)途徑的家蠶絲腺退化延遲發(fā)育模型中30K蛋白質(zhì)的合成變化[A];第十二屆家（柞）蠶遺傳育種暨良種繁育學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（摘要匯編）[C];2016年

4 段建平;徐漢福;馬三垣;鄧黨軍;王峰;夏慶友;;人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因(hBDNF)在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺中的特異表達(dá)[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（1）[C];2009年

5 趙越;李曦;曹廣力;薛仁宇;貢成良;;在轉(zhuǎn)化家蠶培養(yǎng)細(xì)胞和絲腺組織表達(dá)hIGF-Ⅰ[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（2）[C];2009年

6 王欣;陳晨;范洋洋;朱娟;唐順明;沈興家;;家蠶miR-2758體外下調(diào)絲腺轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的表達(dá)[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第八屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2014年

7 劉棟然;王磊;楊柳;錢岑;魏國(guó)清;戴立上;李俊;朱保建;劉朝良;;家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑15抑制酚氧化酶原及抗菌肽的表達(dá)[A];第十二屆家（柞）蠶遺傳育種暨良種繁育學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（摘要匯編）[C];2016年

8 李曦;趙越;曹廣力;薛仁宇;貢成良;;fib-H啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺中的表達(dá)研究[A];中國(guó)蠶學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（1）[C];2009年

9 呂家

本文編號(hào)：2685247