【摘要】：真菌類殺蟲劑是生物農藥產業(yè)的重要組成部分,是一類寄主譜較廣的蟲生真菌,可通過直接穿透昆蟲體壁殺蟲,具高度特異性、對環(huán)境安全,但由于易受環(huán)境影響而限制其應用。因此為克服蟲生真菌的這些缺陷、改良菌株性狀,充分理解蟲生真菌對寄主致病各個環(huán)節(jié)的作用機理是重要的理論基礎。目前真菌在昆蟲體腔內定殖機理研究發(fā)現(xiàn),昆蟲激素能調控昆蟲的免疫反應,但蟲生真菌在血體腔定殖過程與昆蟲激素是否存在直接聯(lián)系尚不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蛻皮激素和保幼激素能引起蟲生真菌鹿兒島被毛孢表型的變化,激素誘導能顯著增加該菌色素產生和孢外粘液的厚度。本論文根據昆蟲激素能調節(jié)被毛孢的孢外粘液分泌這一現(xiàn)象入手,通過比較轉錄組學和孢外粘液蛋白表達譜的聯(lián)合分析,從分子層面解析了鹿兒島被毛孢在寄主體內定殖過程中應對昆蟲蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH)壓力而產生的具體應答分子機理。除了分泌蛋白上調表達,鹿兒島被毛孢中一些昆蟲激素代謝類基因和凝集素類蛋白也參與應答過程。首次從20E誘導產生差異表達的基因中分離鑒定出1個蛻皮激素失活酶Hsegt基因,并進一步研究了該基因的功能。凝集素類蛋白也有參與應答過程,從20E處理組分離鑒定一個具有凝血活性的蛋白Hscal1,功能研究表明該蛋白能結合Ca~(2+)發(fā)揮活性并特異性識別海藻糖。這些主要結果表明鹿兒島被毛孢與兩種昆蟲激素之間存在直接的相互作用關系,昆蟲激素也是蟲生真菌在昆蟲體腔定殖時的脅迫壓力之一,為應對激素引起的昆蟲生理脅迫,真菌進化出了特異性的應對策略。論文為探究蟲生真菌在昆蟲體內定殖機制提供了新的線索。所取得的主要研究結果如下:1.鹿兒島被毛孢應答兩種昆蟲激素的分子基礎鹿兒島被毛孢與蛻皮激素和保幼激素存在直接相互作用關系。模擬家蠶體內激素的中濃度水平,將400 ng/mL濃度的蛻皮激素和250 ng/mL的保幼激素對鹿兒島被毛孢進行誘導培養(yǎng)后,通過轉錄組和蛋白組聯(lián)合分析。結果發(fā)現(xiàn),兩種激素誘導下產生的大部分差異基因與寄主互作相關,說明對激素的應答是真菌在昆蟲體腔定殖的重要環(huán)節(jié)之一。該菌對20E的應答主要集中在脂質代謝及氨基糖類代謝等重要生物學過程;而JH處理組差異表達基因主要參與了核糖體的合成代謝及蛋白的轉錄與翻譯過程。另外胞外分泌蛋白也參與應答反應,兩個處理組共表達蛋白共有45個,大部分蛋白均上調表達,這吻合粘液厚度增加的表型現(xiàn)象。鹿兒島被毛孢應答昆蟲激素存在特異性的應對策略。從轉錄組和蛋白譜中共篩選出三類可能對激素有重要應答作用的基因:(1)昆蟲激素代謝基因,從差異基因的次級代謝途徑中發(fā)現(xiàn)兩條昆蟲激素代謝相關途徑,并首次從該菌中篩選出昆蟲激素代謝相關基因,包括2類蛻皮激素失活酶(EGT和EcKinase)和保幼激素合成途徑中一個關鍵醛脫氫酶,分別受兩種昆蟲激素的誘導而高表達。這類基因的發(fā)現(xiàn)進一步驗證了蟲生真菌與昆蟲激素之間的直接作用關系。(2)寄主家蠶高度同源的分泌性蛋白,包括Fibrohexamerin和Sericin 1等絲蛋白,受保幼激素誘導而顯著性高表達,可能與免疫逃避有關;(3)凝集素類蛋白,該菌中一共篩選出4個與激素應答相關凝集素,參與對寄主識別。2.鹿兒島被毛孢胞外粘液成分及對孢子表面性質的影響粘液影響孢子粘附和毒力。采用溫和洗脫的方法提取胞外粘液并優(yōu)化提取條件,鹿兒島被毛孢分生孢子粘液蛋白的最優(yōu)提取方法為:孢子濃度在5×10~7conidia/mL左右,2 mM的二硫蘇糖醇(DTT),低溫提取24 h。粘液提取后能顯著影響孢子細胞表面性質,使孢子表面疏水性和黏附率下降;同時降低了孢子對大蠟螟和小菜蛾兩種試蟲的毒力。這可能是由于黏液中參與粘附識別、附著胞形成蛋白和昆蟲體壁降解酶被破壞,進而導致毒力下降。粘液成分與其功能聯(lián)系緊密。利用Label-free法鑒定正常生長狀態(tài)下孢子的粘液蛋白譜,并與轉錄組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),鹿兒島被毛孢的野生型孢外粘液共鑒定出474個蛋白,其中7個與黏附相關、13個與寄主體壁破壞及附著胞形成相關、9個與逆境防御機制相關。粘液中還含有包括中性糖、堿性糖和堿不溶性糖等糖類,這些糖類可能是以糖-蛋白結合的方式存在,在昆蟲體腔中與真菌細胞壁重塑和蛋白糖基化相關。粘液中含有凝集素類蛋白。采用非變性的方法對鹿兒島被毛孢分生孢子的孢外粘液進行提取,粘液粗提物具有凝血活性;進一步分離純化,從Sephades G-100分子篩層析中得到一個具有較高凝集活性的蛋白組分Sl(128 unit);SDS-PAGE檢測該組分的分子量為32 KDa。對該組分進行質譜鑒定,得到一個Legume-like lectin(HSL)蛋白,具凝集活性。凝集素能夠參與細胞的識別和粘著,說明粘液也參與寄主識別黏附過程,進一步驗證了粘液能影響孢子毒力。3.重要應答基因蛻皮激素失活酶Hsegt基因和凝集素蛋白Hscal1的功能研究構建了鹿兒島被毛孢遺傳轉化體系。篩選出了鹿兒島被毛孢敏感的抗性標記:除草劑草銨膦(Phosphinothricin,PPT)和氯嘧磺隆(Chlorimuron ethyl,sur),并確定了PPT對鹿兒島被毛孢的抑制濃度為0.5μL/mL;sur的抑制濃度為150μg/mL。優(yōu)化了根癌農桿菌介導轉化鹿兒島被毛孢的方法,成功將綠色熒光蛋白和HtA毒力蛋白的過表達載體轉入該菌野生型菌株并穩(wěn)定表達,基于此方法成功構建了鹿兒島被毛孢的遺傳轉化體系。Hsegt基因的功能研究。對重要應答基因Hsegt進行了生物學功能分析,該基因被注釋為一種蛻皮激素失活酶(Ecdysteroid UDP-glucosyl transferase),屬于egt superfamily,這是首次在蟲生真菌中發(fā)現(xiàn)這類蛻皮激素失活酶�；诼箖簫u被毛孢的遺傳轉化體系,獲得了Hsegt基因的敲除(ΔHsegt)、過表達(OE-Hsegt)及回復(Comp)菌株。該基因的功能研究表明,Hsegt基因的敲除對菌株的毒力無影響,但超量表達后增強了菌株的毒力;Hsegt基因過表達具有20E失活作用,在鹿兒島被毛孢中的上調表達能抑制蟲體內20E的濃度,同時也能抑制蟲體相關抗真菌基因的上調表達和酚氧化酶活性,進一步削弱寄主的免疫反應,使其體內細菌生長失去平衡、大量繁殖,加速寄主死亡。Hscal1蛋白的功能研究。從轉錄組和蛋白組中同時篩選出一個凝集素類蛋白(c7951),對蛻皮激素有特異性響應。對其進行生物信息學分析,該蛋白被注釋為Concanavalin A-like lectin/glucanase,屬于C-Type Lectin家族,具有Ca~(2+)結合位點,將其命名為Hscal1;隨后進行體外表達,得到分子量為45.21 kDa的蛋白,該蛋白具有凝血活性,能結合Ca~(2+)發(fā)揮活性并特異性識別海藻糖,可能參與了真菌在昆蟲體腔內的營養(yǎng)識別與代謝。說明凝集素類蛋白參與鹿兒島被毛孢對蛻皮激素的應答過程。
【圖文】：

以綠僵菌（Metarhizium）為代表的子囊菌（在生活史上不存段）為例，關鍵侵染階段包括：感染繁殖體（例如分生孢子和芽孢子主角質層的表面；感染結構（附著胞和穿透針）的分化；使用酶和機械角質層；血體腔的定植，克服昆蟲免疫，然后殺死寄主；分生孢子在蟲現(xiàn)并開始下一輪侵染（Butt et al., 2016; Wang et al., 2017）。

且孢梗束質地較硬。該菌具有被毛孢屬的典型特征，寄主較大且類群多，生長和產孢相對較快；另外該菌的寄主之一為模式物種——家蠶，其物種遺傳信息完備，便于后續(xù)研究。目前，蟲生真菌致病機理研究的模式真菌多為球孢白僵菌、金龜子綠僵菌、萊氏野村菌等廣譜類真菌，盡管有很廣的寄主譜，但也存在易產生抗性、特異性不強、遺傳菌株應用時轉化基因安全問題等。未來專性、窄譜類蟲生真菌可能是生物農藥的選擇之一，但目前這類真菌致病機理研究極少，因此本論文選用鹿兒島被毛孢作為研究材料，擬構建窄譜類蟲生真菌的模式物種。昆蟲激素能影響昆蟲免疫反應，但目前蟲生真菌與昆蟲激素之間的作用關系尚不明確。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，模擬家蠶幼蟲體內中高激素水平，固體培養(yǎng)基中加入 250 ng/mL 昆蟲保幼激素和 400 ng/mL 蛻皮激素誘導后，，鹿兒島被毛孢的表型會發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為菌落色素分泌增加、孢子外粘液層厚度比對照增加 2-3 倍（圖 2-1）。這個現(xiàn)象說明該菌對昆蟲激素有應答作用。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S476


本文編號：2684208