【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性功能小RNA,在動(dòng)物中廣泛參與細(xì)胞分化、發(fā)育形態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌肉的發(fā)育和維持細(xì)胞存活等方面的調(diào)控,主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解靶基因mRNA、抑制翻譯等作用機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)。蠶絲蛋白基因的表達(dá)不僅有轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同參與,而且還和miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有著密切的聯(lián)系。雖然有很多蠶絲蛋白合成調(diào)控機(jī)制的報(bào)道,但其精密的調(diào)控機(jī)制尚未完全清晰。研究家蠶miRNAs對(duì)蠶絲蛋白表達(dá)的調(diào)控作用,有助于深入了解miRNAs的功能,并為闡明蠶絲蛋白合成調(diào)控的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究以家蠶絲素輕鏈基因?yàn)榘谢?采用生物信息學(xué)分析獲得2個(gè)候選miRNAs,即miR-2805和miR-0031-3p;在半定量RT-PCR進(jìn)行表達(dá)水平分析的基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建靶基因和miRNAs的重組表達(dá)載體,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和qRT-PCR技術(shù),分別在細(xì)胞、離體組織和個(gè)體水平分析miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控作用,取得以下主要結(jié)果。1、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到2個(gè)調(diào)控BmFib-L表達(dá)的候選家蠶miRNA從miRBase下載家蠶miRNAs和本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序獲得可能參與蠶絲蛋白調(diào)控的35個(gè)新家蠶miRNAs,利用生物信息學(xué)軟件RNAhybrid分析,根據(jù)miRNA5’端的第2-8堿基(種子序列)與靶位點(diǎn)的配對(duì)水平和折疊自由能-20.0kcal/mol的原則,篩選出2個(gè)對(duì)BmFib-L具有潛在調(diào)控作用的候選家蠶miRNA,即miR-2805和miR-0031-3p,進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。2、建立了一種TC-100培養(yǎng)基體外培養(yǎng)絲腺組織進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá)分析的方法取健康家蠶5齡2 d幼蟲,解剖獲取絲腺組織,放入含有800μL TC-100培養(yǎng)基的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔4條絲腺,27℃培養(yǎng)。將構(gòu)建的含有綠色熒光蛋白的表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]用EntransterTM-H4000試劑轉(zhuǎn)染到絲腺組織中,48 h后用熒光顯微鏡觀察,培養(yǎng)基清澈,絲腺組織外形完好、發(fā)出亮綠色熒光,表明egfp在絲腺中得到了表達(dá),離體培養(yǎng)絲腺組織進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá)是可行的。該方法的建立為研究蠶絲蛋白基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供新的技術(shù)途徑,也為家蠶其他組織的體外培養(yǎng)和研究提供借鑒。3、組織和個(gè)體水平證實(shí)miR-2805顯著上調(diào)BmFib-L基因的表達(dá)從NCBI中下載miR-2805的前體序列(pre-miR-2805)和BmFib-L 3’UTR序列,分別構(gòu)建pre-miR-2805的表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-2805-SV40]和BmFib-L 3’UTR重組質(zhì)粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3'UTR-SV40],共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞,檢測(cè)miR-2805對(duì)BmFib-L調(diào)控功能;再用人工合成miR-2805的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor),進(jìn)一步驗(yàn)證miR-2805的功能,結(jié)果顯示,miR-2805在卵巢來源的BmN細(xì)胞中,通過與BmFib-L 3'UTR結(jié)合負(fù)調(diào)控其表達(dá)。為了驗(yàn)證miR-2805在家蠶體內(nèi)對(duì)BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用,分別采用5齡幼蟲絲腺離體培養(yǎng)和體腔注射的方法,進(jìn)行過表達(dá)或抑制內(nèi)源性表達(dá),熒光定量分析結(jié)果顯示,miR-2805在離體培養(yǎng)絲腺和幼蟲體內(nèi)都具有顯著上調(diào)BmFib-L表達(dá)的作用。4、證實(shí)miR-2805通過上調(diào)BmAwh和Bmdimm的表達(dá)間接調(diào)控BmFib-L的表達(dá)為了明確細(xì)胞和組織及個(gè)體水平差異的原因,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄因子(TF)SGF-1、SGF-3、MBF1、FMBP-1、BmAwh和Bmdimm的序列,設(shè)計(jì)引物;以上述個(gè)體注射處理幼蟲RNA為模板,A3為內(nèi)參,qRT-PCR技術(shù)定量分析了體內(nèi)過表達(dá)miR-2805或抑制表達(dá)后,絲腺細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,miR-2805能促進(jìn)BmAwh和Bmdimm的表達(dá)。而且生物信息學(xué)分析顯示miR-2805能結(jié)合BmAwh的CDS區(qū)和Bmdimm的5’UTR。因此,我們推測(cè)miR-2805通過BmAwh和Bmdimm間接上調(diào)BmFib-L基因的表達(dá)。5、體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-0031-3p抑制BmFib-L基因的表達(dá)按照上述同樣的方法,構(gòu)建miR-0031-3p表達(dá)載體,并人工合成miR-0031-3p的mimic、mimic negative、inhibitor和inhibitor negative。在細(xì)胞水平進(jìn)行過表達(dá)和抑制內(nèi)源性表達(dá)驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-0031-3p抑制BmFib-L基因表達(dá)。并進(jìn)一步在組織水平進(jìn)行抑制功能驗(yàn)證,將miR-0031-3p的inhibitor及其negative control轉(zhuǎn)染到放有絲腺組織的培養(yǎng)孔中,熒光定量PCR檢測(cè)靶基因BmFib-L的表達(dá)量。結(jié)果顯示,inhibitor抑制miR-0031-3p的作用,促使BmFib-L的表達(dá)量上升,即miR-0031-3p能夠下調(diào)BmFib-L的表達(dá)。采用5齡2d幼蟲體腔注射方法進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證,結(jié)果再次表明,miR-0031-3p抑制BmFib-L 3’UTR基因的表達(dá)。研究結(jié)果有利于深入理解家蠶miRNA的功能,為蠶絲蛋白表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【圖文】：

18圖 2.1 bmo-miRNAs 與 BmFib-L 3' UTR 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 2.1 Target prediction on BmFib-L 3' UTR of bmo-miRNAs miRNAs 的成熟體驗(yàn)證 3 d 幼蟲后部絲腺總 RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄后合成第一鏈 為模板，以成熟體的特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到的（圖 2.2A）。測(cè)序結(jié)果與 miRBase 數(shù)據(jù)庫和宋菲測(cè)序獲得對(duì)，結(jié)果顯示，miR-2805 和 miR-0031-3p 的序列正確(圖確，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。但是，經(jīng)過多次測(cè)序，仍是無法列。所以選取 miR-2805 和 miR-0031-3p 進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)

圖 4.3 BmFib-L 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4.3 Standard curve of the BmFib-L gene-2805 在組織水平促進(jìn) BmFib-L 的表達(dá)巢來源的家蠶 BmN 細(xì)胞中，miR-2805 能夠抑制 BmFib-L 的織中情況如何呢？為此，我們用 TC-100 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)家蠶，設(shè)置過表達(dá)研究的三組處理，，轉(zhuǎn)染 48h 后提取總 RNA，進(jìn)顯示，mimic 和表達(dá)載體 pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-mir-2805-SV數(shù)相接近，均極顯著高于陽性對(duì)照組。結(jié)果表明，在絲腺組 對(duì) BmFib-L 基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用（圖 4.4）。再次為體外試驗(yàn)提供理論數(shù)據(jù)
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S881.26

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9 呂家

本文編號(hào)：2678279