【摘要】：番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)的代表成員,是世界上危害最大的十種植物病毒之一。辣椒是我國重要的蔬菜經(jīng)濟作物,而重慶是我國辣椒的主產(chǎn)區(qū)和集中消費區(qū)之一,辣椒是重慶重點發(fā)展的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。2015年本實驗室在重慶地區(qū)的辣椒上檢出TSWV,目前該病毒已在重慶地區(qū)廣泛發(fā)生。明確重慶地區(qū)辣椒品種對TSWV的抗病性,可為育種工作者提供科學依據(jù),對于防止TSWV在重慶辣椒上的流行具有重要意義。本研究通過對重慶主栽辣椒品種進行人工摩擦接種TSWV,利用斑點酶聯(lián)免疫吸附法(Dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應法(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)對主栽辣椒品種進行抗病性分析,結(jié)合實時熒光定量RT-PCR技術(shù)(Real-time quantitative RT-PCR,RT-qPCR)對不同主栽辣椒品種中TSWV的積累量進行了分析,結(jié)合癥狀觀察及發(fā)病情況來確定重慶主栽辣椒品種的抗病性;最后對TSWV在不同抗病性辣椒上的遺傳變異進行了分析。本研究以8種不同重慶主栽辣椒品種:渝辣10號、渝椒12號、渝椒五號、艷椒425、早春、艷椒11、艷椒417、農(nóng)世纓朝天椒為試驗材料,經(jīng)人工接種TSWV,20天后進行Dot-ELISA檢測和RT-PCR檢測及抗病性調(diào)查,結(jié)果顯示:Dot-ELISA的檢測結(jié)果與RT-PCR的檢測結(jié)果一致;艷椒417的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為51.4%和61.11,在所檢測的8個品種中發(fā)病最嚴重,是對TSWV最為敏感的品種;其次是艷椒425,發(fā)病率和病情指數(shù)為48.6%和45.56;渝辣10號、渝椒12號和朝天椒對TSWV的抗病性次之;而早春和渝椒5號對TSWV抗病性相對較強;艷椒11對TSWV的相對抗病性最強,發(fā)病率和病情指數(shù)分別為17.1%和25.00。為了進一步明確8種不同重慶主栽辣椒品種對TSWV的抗病性,本研究利用RT-qPCR技術(shù)分析不同品種辣椒中病毒的積累量,進一步比較各辣椒品種對TSWV的抗病性。結(jié)果顯示,在8個不同的辣椒品種中,TSWV積累量最高的是艷椒417;其次是朝天椒和艷椒425;渝辣10號和渝椒12號的病毒積累量也較高;早春和渝椒5號的相對較低;而艷椒11中TSWV的積累量最低。結(jié)合癥狀觀察及發(fā)病情況分析,進一步確認艷椒417對TSWV最敏感,艷椒11對TSWV表現(xiàn)相對較強的抗病性。在辣椒接種TSWV后15天(dpi)、30 dpi、60 dpi、85 dpi、100dpi、150 dpi分別檢測不同辣椒品種中TSWV的積累量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的品種在接種后均表現(xiàn)出TSWV積累量先增加后下降的趨勢;其中,艷椒417、渝辣10號、艷椒425、早春和紅纓朝天椒在60 dpi時達到TSWV積累的最高峰;而艷椒11、渝椒12號和渝椒5號在85 dpi時達到TSWV積累的最高峰。艷椒417和艷椒11均為重慶辣椒品種,但抗病性差異很大,為了明確TSWV在這兩個辣椒品種中的變異水平,本研究以不同抗病性的辣椒品種艷椒417和艷椒11為材料,分別接種TSWV,擴增了接種植株中TSWV的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructure protein,NSs)基因,構(gòu)建了艷椒417早期(50 dpi)、后期(150 dpi),艷椒11早期(50 dpi)、后期(150 dpi)4個種群,并對這4個種群的遺傳結(jié)構(gòu)及變異進行了分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSWV NSs基因組種群在不同抗病性的辣椒上的遺傳多樣性不同,TSWV NSs基因組種群在艷椒417上的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為:0.284±0.102、0.00068±0.00042;在艷椒11上的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為:0.649±0.086、0.00088±0.00022。且TSWV NSs基因在這兩種辣椒上未檢測到重組現(xiàn)象。這4個種群的遺傳結(jié)構(gòu)符合病毒“準種”特征,艷椒11早期、艷椒11后期、艷椒417早期、艷椒417后期種群的突變克隆百分率分別為42.10%、38.89%、6.67%、16.67%;各突變頻率分別為5.30×10~(-4)、4.43×10~(-4)、1.32×10~(-4)、1.48×10~(-4),可以看出TSWV NSs基因組種群在艷椒11上的遺傳變異水平高于艷椒417。對4個種群的主序列兩兩對比發(fā)現(xiàn),艷椒11早期和晚期的主序列同源率為100%,艷椒417的早期和晚期的主序列同源率也為100%,但是將艷椒11主序列、艷椒417主序列及接種本氏煙上的NSs基因序列比對,發(fā)現(xiàn)在1500 bp的序列上的766核苷酸位點艷椒11上TSWV NSs基因發(fā)生了A→G的突變類型,而艷椒417及接種本氏煙上的TSWV NSs基因沒有發(fā)生突變,而這一位點的突變導致谷氨酸變?yōu)榱烁拾彼帷＞C上所述,本研究明確了8種重慶主栽辣椒品種對TSWV的抗病情況,其中艷椒417對TSWV的侵染最敏感,而艷椒11表現(xiàn)出最強的相對抗病性;對TSWV在艷椒417和艷椒11中遺傳變異情況的分析表明,TSWV在艷椒11上的遺傳變異更為豐富。本研究對抗TSWV辣椒品種的選育以及TSWV引致病害的有效防控具有一定的參考價值。
【圖文】：

利用 TSWV 的特異性血清進行 Dot-ELISA 檢測。結(jié)果表明，在所檢測的 8 個品種中，艷椒 417 是對 TSWV 最為敏感的品種，檢出率最高為 51.4%；其次是艷椒 425，檢出率為 48.6%；朝天椒、渝椒 12 號和渝辣 10 號對 TSWV 也較為敏感，檢出率分別為 37.1%、34.2%和 28.6%；渝椒五號和早春的檢出率相對較低，分別為 22.9%、20%；艷椒 11 的檢出率最低，僅為 17.1%（表 2-2）。表 2-2 不同品種辣椒接種 TSWV 后 ELISA 檢測結(jié)果Tab.2-2 The Detection of TSWV by ELISA in infected peper辣椒品種 渝椒 12 號 渝辣 10 號 渝椒五號 艷椒 417 艷椒 11 艷椒 425 早春 接種總株數(shù) 35 35 35 35 35 35 35 發(fā)病株數(shù) 12 10 8 18 6 17 7 檢出率（%） 34.2 28.6 22.9 51.4 17.1 48.6 20 3.1.2 接種 TSWV 的不同品種辣椒 RT-PCR 檢測結(jié)果采取 7 dpi 和 20 dpi 時不同主栽辣椒品種（每個品種 7 份樣品，5 次生物學重復）的葉片，用 Trizol 法提取辣椒葉片總 RNA，電泳后可以看到清晰的三條帶：28S、18S、5S（圖 2-1），說明提取總 RNA 的質(zhì)量比較好，可用于后續(xù)的實驗。

第二章 重慶主栽辣椒對 TSWV 的抗性評價以辣椒總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后，用擴增TSWV的特異性引物TSWV CP-F/R：GAAGCAATAAGAGGTAAG/TGCTTTGTTGACACAAGGCA，，對接種的不同品椒樣品進行 RT-PCR 反應（每個品種 35 份樣品）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， 417 檢出率為 51.4%；艷椒 425 為 48.6%；朝天椒檢出率為 37.1%；渝椒 12出率為 34.2%；渝辣 10 號檢出率 28.6%；渝椒 5 號和早春的檢出率相對較低，為 22.9%、20%；艷椒 11 的檢出率最低，僅為 17.1%（圖 2-2）。和 ELISA 檢果一致。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.418

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本文編號：2676880