發(fā)布時(shí)間：2020-05-19 12:22

【摘要】：西葫蘆(Cucurbita pepo L.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜,我國(guó)年均栽培面積及產(chǎn)量均居世界前列,且仍呈逐年增加的趨勢(shì),現(xiàn)已成為農(nóng)民增收及農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要支柱。但目前生產(chǎn)中受病毒病危害嚴(yán)重,其中小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)是危害西葫蘆等瓜類蔬菜的主要病害之一。西葫蘆植株感染ZYMV后產(chǎn)生花葉、扭曲、植株矮化畸形,果實(shí)瘤狀凸凹不平、果肉僵硬苦澀等癥狀,導(dǎo)致果實(shí)的商品性狀降低甚至喪失,產(chǎn)量損失可達(dá)60%以上,甚至絕產(chǎn),造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。培育抗病品種是防治病毒病最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法,而西葫蘆抗病毒育種研究滯后,可利用的抗性資源較少,導(dǎo)致生產(chǎn)上缺乏抗病毒病西葫蘆品種。因此,本研究擬利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩查西葫蘆ZYMV病毒病抗性相關(guān)基因,將有助于發(fā)掘和合理評(píng)價(jià)利用抗病遺傳資源,為西葫蘆抗病毒分子育種提供基因儲(chǔ)備,保障西葫蘆安全生產(chǎn),也為病毒病抗性分子機(jī)理解析提供理論支持。利用苗期人工接種鑒定,我們篩選獲得了高抗與高感ZYMV的西葫蘆自交系材料,并對(duì)西葫蘆ZYMV抗病遺傳規(guī)律進(jìn)行了解析。對(duì)抗、感材料ZYMV病毒接種誘導(dǎo)后提取總RNA,利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩查了ZYMV誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因,并進(jìn)一步對(duì)病毒誘導(dǎo)基因進(jìn)行了表達(dá)譜分析,獲得主要研究結(jié)果如下:1、獲得高抗與高感ZYMV的自交系材料建立了西葫蘆ZYMV病毒病苗期人工接種鑒定評(píng)價(jià)體系,通過對(duì)二百余份西葫蘆種質(zhì)材料進(jìn)行苗期ZYMV病毒接種和性狀鑒定,獲得6份高抗材料和10份高感材料。2、西葫蘆ZYMV抗性性狀由一對(duì)顯性基因控制以高抗自交系CPZR1和高感自交系CPZS1作為親本,配制了六世代分離群體,利用子葉摩擦接種方法接種兩次ZYMV病毒,進(jìn)行抗、感性狀鑒定。結(jié)果表明,各世代中抗、感植株的分離比例符合孟德爾理論分離比,西葫蘆ZYMV抗性性狀由一對(duì)顯性抗病基因控制。3、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得12G以上的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)以抗、感自交系為病毒接種材料,以無病毒緩沖液摩擦接種為對(duì)照處理。接種24個(gè)小時(shí)之后,分別取抗病與感病材料的病毒誘導(dǎo)處理與空白緩沖液誘導(dǎo)處理(對(duì)照)的真葉提取總RNA,形成4個(gè)樣品池。建庫后進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分別獲得了3G以上的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。西葫蘆轉(zhuǎn)錄組GC含量47%左右,Unigene 73148條,平均長(zhǎng)度582.6 bp,長(zhǎng)Unigene(≥1K)11108條。并對(duì)Unigene進(jìn)行了編碼區(qū)預(yù)測(cè)、蛋白序列分析、功能注釋以及表達(dá)豐度分析;獲得兩份材料間可靠SNP位點(diǎn)2287個(gè),SSR位點(diǎn)4129個(gè)。4、獲得ZYMV抗病相關(guān)候選基因33個(gè)抗、感材料間ZYMV病毒誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因有402個(gè)(表達(dá)量差異1倍以上);抗病材料在病毒誘導(dǎo)與對(duì)照處理間差異表達(dá)基因有104個(gè)。經(jīng)對(duì)差異表達(dá)基因的聚類分析、功能注釋、處理間表達(dá)量比較等分析后篩選獲得候選ZYMV抗病相關(guān)基因33個(gè),主要涉及病程相關(guān)基因、細(xì)胞壁形成因子、ATPase亞基編碼基因以及生長(zhǎng)素相關(guān)基因等。利用qPCR對(duì)其中15個(gè)基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析驗(yàn)證,證明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性,并進(jìn)一步明確了這些基因在病毒誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)特點(diǎn)。5、構(gòu)建了兩個(gè)基因的RNAi及植物過表達(dá)載體利用RACE技術(shù)克隆了2個(gè)候選抗病相關(guān)基因(CpGp1與CpPr1)的全長(zhǎng)序列,并構(gòu)建了兩個(gè)基因的RNAi及植物過表達(dá)載體。
【圖文】：

河北工程大學(xué)碩士學(xué)位論文后撒少量 600~800 目金剛砂進(jìn)行摩擦接種，以緩沖液摩擦接種健康西葫蘆幼苗作陰性對(duì)照，25℃~30℃無蟲條件下培養(yǎng)。（3）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參照 Provvidenti教授（1987）制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。2.1.2.2 西葫蘆 ZYMV 病毒病性狀鑒定ZYMV-CH病毒病性狀鑒定：接種 10-15 天后進(jìn)行植株抗病性調(diào)查，共分為 6級(jí)：0 級(jí)，植株無癥狀；1 級(jí)，植株有 1~2 片葉明脈；2 級(jí)，，少數(shù)葉片輕度花葉，形態(tài)正常；3級(jí)，多數(shù)葉片花葉，形態(tài)正常，個(gè)別葉片畸形；4 級(jí)，多數(shù)葉片嚴(yán)重花葉，新葉畸形；5 級(jí)，幾乎所有葉片嚴(yán)重花葉、畸形或植株矮化。2 級(jí)以上包括2級(jí)視為感�。▓D 2-1A）。病情指數(shù) DI=( 級(jí)別×株數(shù)）×100/(總株數(shù)×6）。A B

圖 2-2 高抗與高感 ZYMV 的西葫蘆材料Fig. 2-2 High-resistance and high-sensitivity ZYMV materials of Cucurbita pepoA：抗病材料；B：感病材料；C：抗病植株葉片；D：感病植株葉片A:Disease resistant materials ; B:Sensitive material ;C:Disease resistant plant leaves ; D:Sensible plant leaf在雙親 CPZR1和 CPZS1，以及兩者構(gòu)建的遺傳群體 F1群體、F2群體BC1CPZR1 群體和 BC1CPZS1 群體材料中，親本 CPZR1和 CPZS1分別表現(xiàn)為抗和感��；CPZR1×CPZS1的 F1均表現(xiàn)為抗��；在 F2群體中，抗病植株有 889 株感病植株有 283 株，經(jīng)卡方檢測(cè)，抗病植株和感病植株的分離比為 3：1（表1），符合孟德爾遺傳規(guī)律。BC1CPZR1 群體有 96 株，均表現(xiàn)為抗病性，BC1CPZS1 群體中，抗病植株有 53 株，感病植株有 45 株，經(jīng)卡方檢測(cè)，抗病株和感病植株的分離比例為 1：1（表 2-1）。綜合以上分析，結(jié)果表明西葫ZYMV 抗性性狀由一對(duì)顯性基因控制，在各世代中抗、感植株的分離比例符合德爾遺傳規(guī)律理論分離比（表 2-1）。表 2-1 西葫蘆 ZYMV 抗性性狀遺傳分析Table2-1 Genetic analysis of ZYMV resistance traits in Zucchini群體 抗病單株 感病單株 抗感比理論值 χ2 P
【學(xué)位授予單位】：河北工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.429

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4 梁曉宇;于曉s

本文編號(hào)：2670885