【摘要】：盾殼霉(Coniothyrium minitans)是一種寄生核盤菌的重寄生真菌,對作物菌核病具有顯著的生物防治效果。目前,市場上已有商品化盾殼霉制劑投入使用。研究盾殼霉生長、產(chǎn)孢和寄生相關(guān)機(jī)制,可望提高盾殼霉的生物防治效率。實驗室在前期研究中分離鑒定出一株生長、產(chǎn)孢及寄生菌核等方面均顯著下降的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子ZS-1TN11990,發(fā)現(xiàn)T-DNA插入可能破壞了盾殼霉中編碼甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(sterol C-24 methyltransferase)的基因(CmSMT1)。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究盾殼霉基因CmSMT1的生物學(xué)功能,研究結(jié)果如下:通過比較盾殼霉的基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CmSMT1的全長為1220 bp,包含2個內(nèi)含子和3個外顯子,推定編碼358個氨基酸。通過比對NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有1個Methyltransf_25保守結(jié)構(gòu)域,在C端含有1個Sterol_MT_C保守結(jié)構(gòu)域。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),CmSMT1在盾殼霉中于PDA上生長72 h時表達(dá)量最高。利用分割標(biāo)記法敲除了盾殼霉的CmSMT1,獲得其敲除轉(zhuǎn)化子。研究發(fā)現(xiàn)敲除轉(zhuǎn)化子與野生菌株存在顯著的差異。與T-DNA插入轉(zhuǎn)化子的表型類似,敲除轉(zhuǎn)化子在PDA上形成的菌落為白色,不產(chǎn)生分生孢子器和分生孢子,生長速率與生物產(chǎn)量顯著降低,活性氧含量升高;CmSMT1敲除轉(zhuǎn)化子對山梨醇、甘油和氯化鈉高滲培養(yǎng)基敏感性顯著增強(qiáng),表明該基因與維持細(xì)胞滲透的平衡相關(guān);突變體寄生核盤菌菌絲和菌核的能力均顯著降低。構(gòu)建了CmSMT1的互補(bǔ)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)盾殼霉技術(shù)獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子,互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子均能恢復(fù)以上表型。表明CmSMT1與轉(zhuǎn)化子的不正常表型相關(guān)。對野生菌株ZS-1與敲除轉(zhuǎn)化子的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析比較,發(fā)現(xiàn)兩個敲除轉(zhuǎn)化子的總離子流圖趨勢一致,敲除轉(zhuǎn)化子KO-CmSMT1-1與KO-CmSMT1-2相對于ZS-1分別存在6550個差異代謝組分和6835個差異代謝組分。在p-value≤0.01,fold change≥2的條件下,敲除轉(zhuǎn)化子KO-CmSMT1-1相對于ZS-1存在534個顯著差異代謝組分,顯著上調(diào)的差異代謝物有361個,顯著下調(diào)的差異代謝物有173個;KO-CmSMT1-2相對于ZS-1存在1128個顯著差異代謝組分,顯著上調(diào)的差異代謝物有975個,顯著下調(diào)的差異代謝物有153個。兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行成對差異比較得到379個共有的顯著差異代謝組分。進(jìn)一步利用系統(tǒng)生物學(xué)預(yù)測分析了KO-CmSMT1-1和KO-CmSMT1-2的代謝數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)與麥角甾醇生物合成途徑密切相關(guān)的代謝物(2E,6E)-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的含量顯著下降;另外還發(fā)現(xiàn)與生物體活動相關(guān)的代謝物吡哆醛5'磷酸和4-氨基-2-甲基-5-二磷酸甲基嘧啶含量顯著下降,但核黃素在這兩個敲除轉(zhuǎn)化子中的含量則顯著提高。以上結(jié)果表明CmSMT1對盾殼霉的正常生長、發(fā)育和寄生等生命活動至關(guān)重要;敲除CmSMT1盾殼霉合成(2E,6E)-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的能力顯著下降,從而影響麥角甾醇的合成;而積累了大量的核黃素可能是敲除轉(zhuǎn)化子中活性氧增加的原因。
【圖文】：

酒酵母麥角甾醇生物合成途徑及其相關(guān)基因，不同顏色表示不同的階段Daum 2014）CoA：輔酶 A；HMG-CoA：3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA；P：磷酸鹽，LD 脂滴The ergosterol pathway and related gene in Saccharomyces cerevisiae, differeindicates different modules. (Klug and Daum 2014)A: Coenzyme A; HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; P: phosphate, LD: lipid d角甾醇的生物合成的是一個多酶參與催化的極為復(fù)雜的過程，為例，如圖 1.1 所示，，在釀酒酵母中至少經(jīng)過 20 多步的反應(yīng)lug and Daum 2014）。目前，麥角甾醇的生物合成途徑一般為三羥戊酸生物合成，以乙酰輔酶 A（acetyl-CoA）為原料，到形在釀酒酵母中，第一階段的相關(guān)基因是生長必需的，敲除致死、高等植物以及微生物中都較為保守。該階段涉及 ERG10 基

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文5 盾殼霉 CmSMT1 的基因敲除及驗證5.1 同源重組的原理源重組的原理如圖 2.1 所示，通過融合 PCR 擴(kuò)增，獲得目標(biāo)基因的 與潮霉素基因序列的融合產(chǎn)物（UHY）以及目標(biāo)基因的下游序列 D 與列的融合產(chǎn)物（YGD），然后通過 PEG 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將融合產(chǎn)物導(dǎo)入盾中，根據(jù)三重同源重組，潮霉素基因替換掉目標(biāo)基因，從而獲得目標(biāo)化子（Yu et al 2004）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹龍輝;李曉s

本文編號：2664431