【摘要】：水稻是世界上重要的糧食作物。由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻紋枯病是極具破壞性的水稻病害之一。目前水稻病害研究大多集中在白葉枯病和稻瘟病上,很少有針對(duì)紋枯病的相關(guān)研究。而對(duì)水稻紋枯病的抗病機(jī)制與調(diào)控機(jī)理的研究更是少之又少。當(dāng)前生產(chǎn)上主要是通過培育種植抗病品種來防治作物病害。但由于水稻對(duì)紋枯病的抗性是數(shù)量性狀,所以很難通過常規(guī)育種手段來產(chǎn)生高抗紋枯病品種。紋枯病高抗材料的缺乏限制了其抗性育種。因此研究調(diào)控抗病相關(guān)基因表達(dá)的啟動(dòng)子及其互作轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行抗病育種是防治水稻紋枯病的有效策略。前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),水稻基因Os2H16能夠被紋枯病菌所誘導(dǎo),超量表達(dá)Os2H16增強(qiáng)了水稻對(duì)紋枯病菌的抗性,抑制表達(dá)Os2H16會(huì)使水稻對(duì)紋枯病菌更加敏感。Os2H16基因啟動(dòng)子是能夠被紋枯病菌誘導(dǎo)的病原誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子,并且已經(jīng)鑒定到了該啟動(dòng)子的主要響應(yīng)區(qū)域?yàn)?513 bp至-411 bp以及-411 bp至-309 bp。前期通過煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的存在于-513 bp至-411 bp區(qū)域的能夠獨(dú)立響應(yīng)紋枯病菌的順式元件AATCA。本研究通過將AATCA元件轉(zhuǎn)入水稻中進(jìn)行表達(dá)發(fā)現(xiàn)其可以響應(yīng)紋枯病菌的誘導(dǎo),驗(yàn)證了前期實(shí)驗(yàn)室在煙草瞬時(shí)表達(dá)中的結(jié)果。我們通過DNA pull-down技術(shù)篩選得到與AATCA元件互作的蛋白。隨后運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證了AATCA元件與OsbHLH057蛋白的互作。通過對(duì)OsbHLH057基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其編碼一個(gè)功能未知的蛋白,具有HLH保守結(jié)構(gòu)域,且定位于細(xì)胞核。對(duì)OsbHLH057基因的病原誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其可以受紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá),暗示它可能參與水稻對(duì)紋枯病菌的響應(yīng)。然后我們還構(gòu)建了OsbHLH057基因超量與基因編輯表達(dá)載體,獲得了水稻超量植株和敲除突變體植株,并且檢測(cè)了其下游抗病相關(guān)基因Os2H16的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在敲除突變體中該基因表達(dá)均有一定程度的下調(diào),表明OsbHLH057基因可能通過影響Os2H16的表達(dá)來正調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性。終上所述,本研究對(duì)順式作用元件AATCA及其互作轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH057進(jìn)行研究,為利用調(diào)控抗病基因的表達(dá),來提高水稻紋枯病抗性的研究提供了新的理論基礎(chǔ),對(duì)進(jìn)一步研究水稻對(duì)紋枯病的抗性機(jī)制以及培育抗性水稻品種具有重要的意義。
【圖文】：

Os2H16也進(jìn)行研究，通過截短發(fā)現(xiàn)兩個(gè)受誘導(dǎo)的核心區(qū)間-513到-411與-411到-309，其中-513到-411中存在一個(gè)新的病原誘導(dǎo)元件。該元件位于啟動(dòng)子區(qū)域-508 bp 至-503 bp，其序列為 AATCA，能夠在煙草中響應(yīng)紋枯病菌的誘導(dǎo)。為了鑒定 AATCA 元件及其互作轉(zhuǎn)錄因子的功能，本課題進(jìn)行了以下研究：3.1AATCA 元件病原誘導(dǎo)活性的功能驗(yàn)證之前的啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)在煙草中AATCA元件能夠響應(yīng)紋枯病菌YWK196的誘導(dǎo)。為了驗(yàn)證在水稻中 AATCA 元件能否被病原菌誘導(dǎo)，我們構(gòu)建了 AATCA 元件重復(fù)序列的 35S minimal 啟動(dòng)子表達(dá)載體 2×AATCA-35S mini-GFP，并以空載體為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)入水稻中花 11。獲得轉(zhuǎn)基因植株后，對(duì)其接種 YWK196 18 h 后檢測(cè) GFP 表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有空載體的水稻中，接種與不接種 GFP 信號(hào)強(qiáng)度相似，基本檢測(cè)不到GFP 熒光的表達(dá)，而轉(zhuǎn)有 AATCA 元件的水稻在接種后表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)（圖 1A）。進(jìn)一步利用 GFP 定量分析發(fā)現(xiàn)，其與觀察結(jié)果完全一致（圖 1B）。這一實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了前期煙草上瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果，說明 AATCA 元件能夠響應(yīng) YWK196 的誘導(dǎo)。

3.3AATCA 與 OsbHLH057 在本生煙中的共表達(dá)分析為了驗(yàn)證 OsbHLH057 基因能否激活 AATCA 元件的表達(dá)，我們克隆了 OsbHLH0的 cDNA 序列，然后將其連入 pCXUN-Myc 載體，并構(gòu)建 POs2H16啟動(dòng)子全長(zhǎng)、POs2H啟動(dòng)子全長(zhǎng)缺失 AATCA 元件和 AATCA 的 GFP 載體（圖 3A）。然后分別將 POs2H16動(dòng)子全長(zhǎng)、POs2H16啟動(dòng)子全長(zhǎng)缺失 AATCA 元件和 AATCA 與 OsbHLH057-pCXUN-M在本生煙葉片中共同瞬時(shí)表達(dá)，以 pCXUN-Myc 空載體為對(duì)照。結(jié)果表明，空載體POs2H16啟動(dòng)子全長(zhǎng)、POs2H16啟動(dòng)子全長(zhǎng)缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 同注射的煙草葉片中均檢測(cè)不到熒光信號(hào)，而同時(shí)轉(zhuǎn)有 OsbHLH057 與 POs2H16啟動(dòng)子長(zhǎng)、POs2H16啟動(dòng)子全長(zhǎng)缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 的煙草葉片中可檢測(cè)到 GFP 的表達(dá)，其中全長(zhǎng)啟動(dòng)子缺失 AATCA 元件后熒光信號(hào)減弱（圖 3B，3C）說明 OsbHLH057 在植物體內(nèi)可以與 AATCA 元件結(jié)合并激活 AATCA 的表達(dá)，，且可以活 POs2H16啟動(dòng)子不僅僅是依賴 AATCA 元件。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650753