【摘要】：柑桔黃龍病是柑桔產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害,而柑桔木虱Diaphorina citri Kuwayama是傳播柑桔黃龍病病菌Candidatus Liberibacter asiaticus的主要媒介。由于迄今尚未發(fā)現(xiàn)能有效防治柑桔黃龍病的藥劑,因此對傳播媒介柑桔木虱的防治是控制柑桔黃龍病田間傳播與擴(kuò)散最為有效的措施。當(dāng)前,化學(xué)防治是防控柑桔木虱最主要的方法。此外,基于高效誘殺柑桔木虱的綠色防控技術(shù)研發(fā)是各國學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。本學(xué)位論文利用柑桔木虱基因組和觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用RT-qPCR的方法解析柑桔木虱嗅覺受體在不同氣味刺激以及在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式,為發(fā)掘潛在的分子靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)采用RT-PCR方法克隆柑桔木虱嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA全長序列,通過共轉(zhuǎn)染進(jìn)入異源表達(dá)系統(tǒng)(HEK293細(xì)胞),利用鈣離子成像技術(shù)初步探究柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18對月桂烯的結(jié)合活性。研究成果為揭示柑桔木虱嗅覺受體的靶標(biāo)潛力以及為研制新型的引誘劑或趨避劑防控柑桔木虱提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1柑桔木虱嗅覺受體基因表達(dá)模式解析柑桔木虱經(jīng)5%月桂烯和5%丁酸乙酯分別刺激5 h,采用RT-qPCR方法解析40個(gè)嗅覺受體基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,共有8個(gè)嗅覺受體基因?qū)煞N氣味物質(zhì)的刺激產(chǎn)生反應(yīng)。其中,在5%月桂烯刺激下,7個(gè)嗅覺受體基因的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),包括DcitOR4、DcitOR7、DcitOR9、DcitOR17、DcitOR18、DcitOR21和DcitOR28。在5%丁酸乙酯刺激下,僅有2個(gè)嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOR46表達(dá)量下調(diào)。值得注意的是,相比于丁酸乙酯,柑桔木虱經(jīng)月桂烯刺激后表達(dá)下調(diào)的嗅覺受體基因更多,說明柑桔木虱對柑桔揮發(fā)物月桂烯的刺激更為敏感。除此之外,DcitOR18對月桂烯和丁酸乙酯的刺激均產(chǎn)生反應(yīng),說明DcitOR18可能在柑桔木虱嗅覺系統(tǒng)具有重要作用。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR解析非典型嗅覺受體基因DcitOrco和8個(gè)候選嗅覺受體基因在柑桔木虱不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DcitOrco在若蟲和成蟲期的表達(dá)量較低且相對穩(wěn)定,而其余8個(gè)候選DcitORs在柑桔木虱各發(fā)育階段均有表達(dá),且在3-4齡若蟲期表達(dá)量最高,暗示這些嗅覺受體可能在柑桔木虱3-4齡若蟲期發(fā)揮重要作用。2柑桔木虱嗅覺受體基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA克隆基于柑桔木虱基因組和觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用RT-PCR技術(shù),克隆獲得柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18和DcitOrco的cDNA全長序列。其中,DcitOR18含有1401個(gè)核苷酸,編碼467個(gè)氨基酸,DcitOrco含有1386個(gè)核苷酸,編碼461個(gè)氨基酸。利用TMHMM預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示DcitOR18僅有4個(gè)跨膜區(qū),而DcitOrco有7個(gè)跨膜區(qū),符合非典型嗅覺受體的結(jié)構(gòu)特征。多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),不同昆蟲嗅覺受體Orco的氨基酸序列高度保守,同源性高達(dá)70%,柑桔木虱DcitOrco在進(jìn)化上亦較為保守,其親緣關(guān)系與蚜蟲的Orco更為接近。3柑桔木虱嗅覺受體DcitOR18和DcitOrco異源表達(dá)及功能驗(yàn)證通過改造哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1(+),融入mcherry紅色熒光蛋白基因,構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-mcherry。將柑桔木虱DcitOR18和DcitOrco分別插入該載體,成功構(gòu)建了pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mcherry轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,檢測到紅色熒光信號,表明HEK293細(xì)胞表達(dá)mcherry紅色熒光蛋白。進(jìn)一步將上述兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞,利用鈣離子成像技術(shù),發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入月桂烯刺激時(shí),細(xì)胞的熒光明顯增強(qiáng),而僅轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mcherry時(shí),HEK293細(xì)胞熒光雖有所增強(qiáng),但比共轉(zhuǎn)染兩種重組質(zhì)粒pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18時(shí)弱。為進(jìn)一步確定這一關(guān)系,構(gòu)建HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)DcitOrco株系,在mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞過表達(dá)DcitOrco,達(dá)1400倍,但在蛋白水平未檢測到DcitOrco的表達(dá),這為全面解析柑桔木虱嗅覺受體的功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 柑桔木虱卵及若蟲（1-5th）外部形態(tài)Fig 1.1 Morphological feature of Diaphorina citri from egg to nymphs (1-5th). 柑桔木虱傳播柑桔黃龍病柑桔黃龍病病菌 Candidatus Liberibacter 屬于原核生物變形菌門變形菌綱韌皮部屬，目前普遍認(rèn)為黃龍病病菌屬于革蘭氏陰性菌[8]。根據(jù)黃龍病病原菌的熱敏感分為耐熱型的亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus，Las）和美洲種（Candideribacter americanus，Lam）以及熱敏感型的非洲種（Candidatus Liberibacter africanf）。目前研究發(fā)現(xiàn)亞洲柑桔木虱可傳播亞洲種和美洲種，而非洲柑桔木虱傳播非洲柑桔木虱傳播柑桔黃龍病可分為獲取病原菌（acquisition access period,AAP）、潛latency period，，LP，病原菌進(jìn)入柑桔木虱的唾液腺）以及接種（inoculation access peP）三個(gè)階段[1]。先前的研究表明，柑桔木虱獲取病原菌所需時(shí)間為 15 min 至 1 潛伏期為 1-25 d，接種所需時(shí)間為 15 min 至 7 h[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR 和 qP

圖 1.2 昆蟲嗅覺生理過程模式圖（引自 Sánchezgracia[42]）Fig 1.2 Schematic of insect olfactory physiology process (originating from Sánchezgracia).2 昆蟲嗅覺受體的鑒定和特性1991 年，Buck 和 Axel 首次在褐家鼠 Rattus norvegicus 鼻粘膜上鑒定了大量的體，揭開了哺乳動物嗅覺感受之謎[48]。而昆蟲嗅覺受體的發(fā)現(xiàn)較滯后，直到rosophila melanogaster 基因組測序完成之后才鑒定出 62 個(gè)果蠅嗅覺受體[49-51]。隨
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2640419