【摘要】：桿狀病毒是一類大分子雙鏈環(huán)狀DNA囊膜病毒。在感染周期中,桿狀病毒通常產(chǎn)生出芽型(budded virions,BV)和包埋型(occlusion-derived virions,ODV)兩類形態(tài)各異的病毒粒子。ODV起始感染昆蟲中腸上皮細(xì)胞,而BV能感染除中腸上皮細(xì)胞以外的其它組織細(xì)胞以及離體培養(yǎng)的細(xì)胞系。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple mucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是目前較廣泛深入研究的桿狀病毒代表種,其出芽型病毒粒子BV通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑(clathrin-mediated endocytosis,CME)進(jìn)入宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,在AcMNPV BV侵染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)Tnms42細(xì)胞過程中顯著上調(diào)了包括dynamin,rab5,rab11等內(nèi)吞途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平,然而,關(guān)于這些宿主因子在BV入侵和出芽釋放過程中的作用尚不清楚。在本文中,首先為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),我們選用實(shí)時熒光定量PCR檢測AcMNPV BV感染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9細(xì)胞后不同時間dynamin與4個rab基因(rab4,rab5,rab7,rab11)的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果表明,在AcMNPV感染早期(0-6 h),dyamin,rab5與ra11的表達(dá)水平顯著上調(diào)。采用dynamin特異性抑制劑dynasore處理Sf9細(xì)胞或選用基于雙鏈RNA的RNA干擾(RNA interference,RNAi)下調(diào)dynamin的表達(dá)水平均顯著抑制感染性BV的產(chǎn)生;深入分析發(fā)現(xiàn),抑制dynamin活性不影響B(tài)V與Sf9細(xì)胞結(jié)合,卻顯著降低BV的入侵效率。激光共聚焦分析顯示,mCherry標(biāo)記的BV在入侵過程中明顯與GFP標(biāo)簽的Rab5及Rabll存在共定位現(xiàn)象,而過表達(dá)Rab5和Rab11的顯性-負(fù)性突變體(dominant-negative mutants,DN)或RNAi下調(diào)rab5和rab11的表達(dá)水平,顯著影響感染性BV的產(chǎn)生;進(jìn)一步分析表明,過表達(dá)rab5與rab11的DN突變體不影響B(tài)V與Sf9細(xì)胞結(jié)合,但顯著抑制BV入侵效率。采用同樣類似方法的分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Rab4或Rab7的DN突變體或RNAi下調(diào)其編碼基因的表達(dá)水平不影響感染性BV的產(chǎn)量。通過低pH誘導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜直接融合或通過重組bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞分析顯示,在過表達(dá)Rab5與Rab11的細(xì)胞中,感染性BV產(chǎn)量與對照組(過表達(dá)GFP)比較沒有顯著差異,進(jìn)一步揭示BV的入侵依賴于Rab5與Rab11,而感染性BV的出芽釋放則與Rab5或Rab11無關(guān)。此外,RNAi下調(diào)Sf9細(xì)胞中內(nèi)吞分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體Ⅲ(the endosomal sorting complex required for transportⅢ,ESCRT-Ⅲ)組分Vps2B,Vps20,Vps24,Snf7,Vps46及Vps60編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著抑制AcMNPV BV的入侵和出芽釋放。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測AcMNPV BV在早期內(nèi)吞體(early endosome)或者在早期內(nèi)吞體逐漸成熟的過程中發(fā)生了病毒囊膜與內(nèi)吞體膜融合,在到達(dá)晚期內(nèi)吞體(late endosome)之前就釋放出了病毒核衣殼。另外,我們推測Rabll調(diào)控一部分入侵病毒粒子可能從早期內(nèi)吞體直接進(jìn)入循環(huán)內(nèi)吞體(recycle endosome)并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜釋放,這種侵染策略可以快速傳播病毒粒子到鄰近細(xì)胞從而促進(jìn)病毒感染效率。
【圖文】：

環(huán)侵染脂肪體和肌肉細(xì)胞，通過ＢＶ在各個細(xì)胞間不斷侵染，最終使整個昆蟲個體都充逡逑滿了病毒粒子，引起宿主的死亡與解體。宿主細(xì)胞內(nèi)的ＯＢ則散落在自然界中，完成侵逡逑染循環(huán)這是次級暴染過岕，也叫系統(tǒng)感染（圖１＿２）邋（Ｂｌｉｓｓａｒｄ邋ａｎｄ邋Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ，邋２0１８；邋Ｈａｗｔｉｎ逡逑ｅｔ邋ａｌ．

員ＡｃＭＮＰＶ也是較多研宄的模式物種的囊膜蛋白為ＧＰ６４，Ｇｒｏｕｐ邋ＩＩ的代表成員有逡逑ＨｅａｒＮＰＶ，它的囊膜蛋白為Ｆ蛋白（Ａｃ２３）邋（Ｌｕｎｇｅｔａｌ．，邋２００２）。將兩種病毒的ＢＶ和逡逑ＯＤＶ的核衣殼和囊膜蛋白進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)（如圖１－４所示），ＡｃＭＮＰＶ共有５７個核衣殼逡逑蛋白，其中２４個為ＢＶ和ＯＤＶ共有蛋白，１４個為ＢＶ特有蛋白，１７個為ＯＤＶ特有逡逑蛋白。對ＡｃＭＮＰＶ而言，２１個囊膜蛋白中有６個蛋白為ＢＶ和ＯＤＶ共有蛋５個逡逑為ＢＶ特有囊膜蛋：白＞１０個為ＯＤＶ特有囊膜蛋白。而ＨｅａｒＮＰＶ有１０個ＢＶ特有核衣逡逑殼蛋良１０個ＯＤＶ特有核衣殼蛋白，１８個ＢＶ和ＯＤＶ共有蛋白；１８個囊膜蛋白中逡逑有３個蛋掃為ＢＶ和ＯＤＶ共有蛋白，３個ＢＶ特有囊膜蛋白，１２個ＯＤＶ特有囊膜蛋逡逑白＾對這兩種病毒而言個基Ｈ的位置也有很大差異，，比如Ａｃ２３／Ｆ蛋白是ＨｅａｒＮＰＶ逡逑的ＢＶ特有囊膜蛋而在ＡｃＭＮＰＶ里面該蛋白h剩攏趾停希模止?fàn)N心夷さ鞍�；Ａｃ９８辶x鮮牽粒悖停危校皺澹攏痔賾瀉艘驢塹鞍祝蛟冢齲澹幔潁危校擲錈嬖蚴牽攏趾停希模止?fàn)N瀉艘驢塹鞍祝誨義希粒悖福笆牽粒悖停危校皺澹希模痔賾心夷さ鞍祝冢齲澹幔潁危校擲錈嬡詞牽攏趾停希模止?fàn)N瀉艘驢清義系鞍祝ㄍ跡保擼�，注意o街植《糾鏘嗤恢玫耐桓齷蚨加美渡碧遄直曜ⅲｅ義掀浯

本文編號：2639452