【摘要】：煙粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))是一種世界性的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),主要通過(guò)刺吸植物韌皮部汁液、分泌蜜露、傳播多種植物病毒等對(duì)寄主植物產(chǎn)生直接和間接的危害,進(jìn)而影響寄主植物的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。鈣結(jié)合蛋白作為鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分,通過(guò)與所有真核生物中普遍存在且必不可少的鈣離子結(jié)合實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能,能夠調(diào)控細(xì)胞生命周期與信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。植物在感知病原體相關(guān)分子模式后,Ca~(2+)升高是植物中最早的信號(hào)傳導(dǎo)事件之一,鈣離子濃度高時(shí)篩管分子彌散舒張,堵塞汁液流通,濃度低時(shí)篩管分子收縮,汁液順利流通,鈣結(jié)合蛋白可以通過(guò)降低鈣離子濃度來(lái)保持昆蟲(chóng)從韌皮部篩管中持續(xù)攝取,鈣結(jié)合蛋白可能在煙粉虱與寄主植物的互作中發(fā)揮著重要作用。為明確鈣結(jié)合蛋白在Q煙粉虱體內(nèi)發(fā)揮的作用,本文對(duì)煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的功能進(jìn)行了初步探索。首先對(duì)煙粉虱鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行了基因克隆、序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建以及使用亞細(xì)胞定位的方法對(duì)鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位;然后對(duì)鈣結(jié)合蛋白在煙粉虱不同組織、不同齡期、不同寄主、饑餓誘導(dǎo)取食后不同時(shí)間段的表達(dá)模式進(jìn)行了差異分析;最后對(duì)鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行了谷枯菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)并利用RNAi技術(shù)對(duì)鈣結(jié)合蛋白干擾后的煙粉虱的存活率和繁殖力進(jìn)行了生物測(cè)定分析。主要研究結(jié)果如下:1、鈣結(jié)合蛋白的生物信息學(xué)分析及定位(1)通過(guò)基因克隆的方法得到煙粉虱的鈣結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)。其開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)序列為669 bp,序列分析顯示,煙粉虱鈣結(jié)合蛋白是一個(gè)長(zhǎng)為222個(gè)氨基酸的蛋白,預(yù)測(cè)分子量為24.55 kDa,理論等電子點(diǎn)pI為4.64,信號(hào)肽為21個(gè)氨基酸且不具有跨膜信號(hào)。具有EF hand手型保守結(jié)構(gòu)域,在靠近氨基酸序列的C-末端具有鈣結(jié)合位點(diǎn)。(2)運(yùn)用MEGE6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)將鈣結(jié)合蛋白推導(dǎo)出來(lái)的氨基酸序列與NCBI已公布的其他昆蟲(chóng)鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果表明:煙粉虱鈣結(jié)合蛋白與半翅目昆蟲(chóng)甘蔗黃蚜Sipha flava和高粱蚜Melanaphis sacchari關(guān)系最近,分屬同支,與鱗翅目昆蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera、夏威夷紅蛺蝶Vanessa tameamea、斜紋夜蛾Spodoptera litura和膜翅目昆蟲(chóng)家蟻Monomorium pharaonis、阿根廷蟻Linepithema humile、螞蟻Trachymyrmex cornetzi進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。(3)進(jìn)行了鈣結(jié)合蛋白亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。將鈣結(jié)合蛋白構(gòu)入pCAMBIA1300(GFP標(biāo)簽)表達(dá)載體,與綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行融合表達(dá),轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,進(jìn)行煙草注射后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察煙粉虱鈣結(jié)合蛋白在本氏煙煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,鈣結(jié)合蛋白定位于煙草的細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。2、鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)模式(1)利用熒光定量PCR對(duì)煙粉虱不同組織中鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了差異分析。結(jié)果表明:鈣結(jié)合蛋白在煙粉虱體內(nèi)各個(gè)組織中都有表達(dá),在煙粉虱胸、腹、足和翅膀中鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量分別為煙粉虱頭中鈣結(jié)合蛋白表達(dá)量的0.5985、0.8529、0.6897和0.5067倍,其中,煙粉虱的頭部鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量最高,顯著高于其他部位;翅中鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量最低,顯著低于煙粉虱其他部位鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量;腹部鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量顯著高于胸部、足和翅;胸部與足鈣結(jié)合蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性差異。(2)利用熒光定量PCR對(duì)不同發(fā)育期煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了差異分析。結(jié)果表明:鈣結(jié)合蛋白在煙粉虱生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá),其中鈣結(jié)合蛋白在煙粉虱卵期的表達(dá)量最低,顯著低于其他齡期,在煙粉虱一二齡、三齡、四齡、成蟲(chóng)期鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量分別為煙粉虱卵期鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量的4.38倍、5.47倍、16.76倍和5.03倍;四齡若蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)量最高,顯著高于其他齡期;一二齡、三齡、及成蟲(chóng)期三個(gè)階段煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量之間無(wú)顯著性差異。(3)利用熒光定量PCR對(duì)饑餓誘導(dǎo)取食后不同時(shí)間段煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了差異分析。結(jié)果表明:經(jīng)饑餓誘導(dǎo)后取食的煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量顯著升高,取食后不同時(shí)間點(diǎn)(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、12 h)的煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量均顯著高于取食0h的煙粉虱成蟲(chóng)鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量,分別為取食0 h的2.12、1.6291、1.7077、1.9114、1.5438和1.7066倍;取食1 h與4 h時(shí)煙粉虱成蟲(chóng)中鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(0 h、2 h、3 h、5 h、12 h),但二者表達(dá)量之間無(wú)顯著性差異。(4)利用熒光定量PCR對(duì)煙粉虱鈣結(jié)合蛋白在寄主適應(yīng)性方面的作用進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明:取食辣椒和番茄的煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量略高于取食棉花的煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量,但三者之間無(wú)顯著性差異。3、鈣結(jié)合蛋白功能的初步驗(yàn)證(1)利用谷枯菌Burkholderia glumaeⅢ型分泌系統(tǒng),將構(gòu)建好的pEDV::Ca~(2+)-binding protein表達(dá)載體在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。從煙草表型變化可以看出,注射攜帶pEDV空載的谷枯菌會(huì)引起煙草表型的變化,造成煙草葉片的程序性壞死反應(yīng),而注射鈣結(jié)合蛋白的位點(diǎn)也出現(xiàn)了程序性壞死反應(yīng),表明鈣結(jié)合蛋白未能抑制谷枯菌所引起的植物防御反應(yīng)。(2)進(jìn)行了鈣結(jié)合蛋白R(shí)NAi干擾引物的篩選。利用熒光定量PCR對(duì)設(shè)計(jì)的4對(duì)干擾引物dsCa-F1、dsCa-F2、dsCa-F3、dsCa-F4干擾煙粉虱2天、3天時(shí)煙粉虱鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了分析,dsCa-F2干擾3天時(shí)干擾效率最高最穩(wěn)定,因此選擇dsCa-F2作為干擾引物,取干擾后3天的煙粉虱雌成蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)。(3)進(jìn)行了鈣結(jié)合蛋白干擾后煙粉虱的存活率測(cè)定,將飼喂dsEGFP和dsCa三天的煙粉虱放在番茄苗上取食3天,對(duì)煙粉虱的存活率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:鈣離子結(jié)合蛋白被干擾后的煙粉虱的存活率略低于對(duì)照dsEGFP的煙粉虱的存活率,但兩者之間無(wú)顯著性差異。(4)進(jìn)行了鈣結(jié)合蛋白R(shí)NAi干擾后煙粉虱的繁殖力測(cè)定,將飼喂dsEGFP和dsCa三天的煙粉虱放在番茄苗上取食3天,對(duì)煙粉虱的單雌產(chǎn)卵量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:鈣離子結(jié)合蛋白被干擾后的煙粉虱的單雌產(chǎn)卵量顯著低于對(duì)照dsEGFP的煙粉虱的單雌產(chǎn)卵量,干擾后的煙粉虱的平均單雌產(chǎn)卵量為9.35粒,而dsEGFP處理的煙粉虱的平均單雌產(chǎn)卵量為12.88粒。
【圖文】：

吸附柱重新放入收集管中；的 Buffer PB 與 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入吸附柱中，室溫靜置心 1 分鐘，棄廢液（吸附柱容納體積為 750 ul，若入）；0 ul Buffer PW 溶液（使用前檢查是否已加入無(wú)水溫靜置 3 - 5 分鐘，，13000 rpm 離心 1 分鐘，棄廢液rpm 空甩 1 分鐘，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新 1.5 ml 離心管 - 50μl Buffer EB 加入吸附柱中心位置（勿碰到吸附13000 rpm 離心 1 分鐘，棄去吸附柱。產(chǎn)物保存于物連接 T 載體進(jìn)行序列驗(yàn)證受態(tài)細(xì)胞為全式金 Trans1 - T1 Phage Chemically C pEASY - T1 Cloning Kit，T1 載體結(jié)構(gòu)如圖所示

2.1.11 鈣結(jié)合蛋白序列分析和進(jìn)化分析使用 ExPAsyPro-temics Server (http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用 SignalP 4.1 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 進(jìn)行信 號(hào) 肽 預(yù) 測(cè) ； 跨 膜 結(jié) 構(gòu) 域 的 預(yù) 測(cè) 使 用 TMHMN2.0.(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；使用 MEGA 6.0 軟件采用鄰接法(Neighbor - joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支均進(jìn)行 1000 次重復(fù)檢驗(yàn)。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 鈣結(jié)合蛋白的克隆及序列分析通過(guò)基因克隆的方法得到煙粉虱的鈣結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)（GenBank 登錄號(hào)為XP_018909727.1）（圖 2-2）。其開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)序列為 669bp，序列分析顯示，煙粉虱鈣結(jié)合蛋白是一個(gè)長(zhǎng)為 222 個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為 24.55kDa，理論等電子點(diǎn) pI 為 4.64。使用 SignalP4.1 及 TMHMN2.0 預(yù)測(cè)其信號(hào)肽為 21個(gè)氨基酸且不具有跨膜信號(hào)。在靠近氨基酸序列的 C - 末端具有鈣結(jié)合位點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S433.3

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