【摘要】：第一部分電子斷層三維重構(gòu)術(shù)研究植物病毒細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)某⒔Y(jié)構(gòu)背景:病毒成功注入宿主細(xì)胞是其感染和傳播關(guān)鍵步驟。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn),病毒可以利用和修飾使植物細(xì)胞相連的復(fù)雜細(xì)胞質(zhì)橋——胞間連絲。利用胞間連絲進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的病毒需要借助由病毒自身編碼的一種或多種運(yùn)動(dòng)蛋白輔助,但是胞間連絲的結(jié)構(gòu)和組分都顯示其存在尺寸排阻極限。近些年,在水稻的篩管細(xì)胞界面上觀察到一種柔性的胞間通道——側(cè)向篩域通道,這種胞間通道存在于多種呼腸孤病毒侵染的植物組織中。側(cè)向篩域通道結(jié)構(gòu)類似壓縮的胞間連絲,可以容納直徑約80nm的完整病毒粒子,促進(jìn)病毒在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。目的:建立基于連續(xù)切片與多視野拼接的電子斷層三維重構(gòu)成像實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程,解析病毒粒子在植物細(xì)胞間運(yùn)輸通道——側(cè)向篩域通道的超微結(jié)構(gòu),統(tǒng)計(jì)分析該通道的不同形態(tài)與結(jié)構(gòu)。方法:將水稻齒葉矮縮病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)感染的水稻組織制備成樹脂包埋塊,并制備連續(xù)半薄切片(～200nm)。利用200kV透射電子顯微鏡與SerialEM軟件進(jìn)行自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集,獲取目標(biāo)結(jié)構(gòu)的一系列不同角度的多視野拼接二維投影。進(jìn)一步使用IMOD軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)、三維重構(gòu)及連續(xù)三維重構(gòu)數(shù)據(jù)的疊加;隨后利用Amira軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行人工分割和渲染,并對(duì)不同形態(tài)類型的通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:通過對(duì)多套電子斷層三維重構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)側(cè)向篩域通道存在關(guān)閉和開放兩種狀態(tài)。此外,我們發(fā)現(xiàn)了幾類不同形態(tài)的側(cè)向篩域通道:位于細(xì)胞壁邊緣、半通狀態(tài)和貫穿狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)側(cè)向篩域通道的直徑范圍在16～137nm,并且在細(xì)胞壁中是一個(gè)非連續(xù)的結(jié)構(gòu)。結(jié)論:基于連續(xù)切片的電子斷層三維重構(gòu)成像技術(shù)能夠更加完整的重建側(cè)向篩域通道的三維超微結(jié)構(gòu),避免了傳統(tǒng)基于單張二維投影圖像分析可能存在的偏差,為進(jìn)一步探究病毒侵染宿主提供了結(jié)構(gòu)信息。第二部分人源α5β3γ-氨基丁酸A型受體的冷凍電鏡三維重構(gòu)背景:γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體是半胱氨酸環(huán)型配體門控離子通道超家族的一員,快速介導(dǎo)抑制性神經(jīng)傳遞,對(duì)控制大腦的興奮性至關(guān)重要。功能失調(diào)的GABAA受體會(huì)引發(fā)許多神經(jīng)疾病和精神疾病。人類GABAA受體通常由19種不同亞基(α,β,γ,δ,ε,θ,π和ρ亞基)組成異五聚體,具有不同亞基組成和排列的受體亞型有不同的生物物理和藥理學(xué)性質(zhì)。目的:獲得GABAA受體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu),探索此類受體的組裝原理和GABA配體在α/β亞基界面結(jié)合位點(diǎn)及作用機(jī)制,通過GABAA受體結(jié)構(gòu)對(duì)通道門控機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的生物物理分析。方法:使用HEK293-GnTl-細(xì)胞過表達(dá)人源α5β3 GABAA受體,GABAA受體-Nb25復(fù)合物在1mMGABA存在下共純化,并用于制備冷凍電鏡的樣品載網(wǎng),通過冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)重建其三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果:獲得了α5β3 GABAA受體異五聚體3.51A的冷凍電鏡結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)顯示一個(gè)α亞基和4個(gè)β亞基的亞基化學(xué)計(jì)量組成。并且獲得與觀察GABA結(jié)合在β(+)/α(-)界面處的規(guī)范的配體結(jié)合“芳香籠”結(jié)果一致。結(jié)論:GABAA受體在脫敏和開放狀態(tài)的結(jié)構(gòu)比較揭示了由細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的軀體運(yùn)動(dòng)引起的四元激活機(jī)制。α5β3 GABAA受體僅含有一個(gè)GABA結(jié)合位點(diǎn),代表最簡(jiǎn)單的異五聚體GABAA受體,為我們進(jìn)一步對(duì)通道門控機(jī)制進(jìn)行生物物理分析提供了參考。
【圖文】：

邐植物病毒細(xì)胞間運(yùn)輸通道的三維結(jié)構(gòu)研究逡逑的內(nèi)部核心顆粒直徑約５０ｎｍ［２１】（圖２．１0。直到２００８年獲得了邋ＲＲＳＶ低分辨的逡逑衣殼結(jié)構(gòu)［２２］，結(jié)構(gòu)顯示病毒粒子除了塔突外，核心衣殼的直徑為５４０邋Ａ邋（圖２．２）。逡逑塔突由兩部分組成：一個(gè)寬度為１５０Ａ、高度為９０Ａ的長(zhǎng)塔突，以及長(zhǎng)度為７０Ａ、逡逑高度為５５邋Ａ的外圍三角翼。這類三聚體在已知的呼腸孤病毒中是ＲＲＳＶ獨(dú)有的，逡逑并且每個(gè)三聚體結(jié)合三個(gè)鉗夾蛋白。逡逑ｍｍｍｒｎ逡逑圖２．１用戊二醛固定并用醋酸雙氧鈾染色的ＲＲＳＶ顆粒的電子顯微照片。逡逑Ａ、Ｂ：純化的病毒顆粒；標(biāo)尺分別為２００ｎｍ、５０ｎｍ；邋Ｃ：病毒核心顆粒，標(biāo)尺為逡逑２００邋ｎｍ［２１］0逡逑ｌ＾ＨＢ逡逑圖２．２邋ＲＲＳＶ的衣殼結(jié)構(gòu)。逡逑Ａ：邋ＲＲＳＶ表面結(jié)構(gòu)表示；Ｂ：中央橫截面。根據(jù)距離病毒顆粒中心的距離對(duì)地圖逡逑進(jìn)行著色，以此指示顏色編碼。核心衣殼：黃色；鉗夾蛋白質(zhì)：綠色；長(zhǎng)塔突：位逡逑于五次軸處的藍(lán)色結(jié)構(gòu)；周邊三聚體，位于塔突周圍的淺藍(lán)色三聚體【２２】。逡逑７逡逑

邐植物病毒細(xì)胞間運(yùn)輸通道的三維結(jié)構(gòu)研究逡逑的內(nèi)部核心顆粒直徑約５０ｎｍ［２１】（圖２．１0。直到２００８年獲得了邋ＲＲＳＶ低分辨的逡逑衣殼結(jié)構(gòu)［２２］，結(jié)構(gòu)顯示病毒粒子除了塔突外，核心衣殼的直徑為５４０邋Ａ邋（圖２．２）。逡逑塔突由兩部分組成：一個(gè)寬度為１５０Ａ、高度為９０Ａ的長(zhǎng)塔突，以及長(zhǎng)度為７０Ａ、逡逑高度為５５邋Ａ的外圍三角翼。這類三聚體在已知的呼腸孤病毒中是ＲＲＳＶ獨(dú)有的，，逡逑并且每個(gè)三聚體結(jié)合三個(gè)鉗夾蛋白。逡逑ｍｍｍｒｎ逡逑圖２．１用戊二醛固定并用醋酸雙氧鈾染色的ＲＲＳＶ顆粒的電子顯微照片。逡逑Ａ、Ｂ：純化的病毒顆粒；標(biāo)尺分別為２００ｎｍ、５０ｎｍ；邋Ｃ：病毒核心顆粒，標(biāo)尺為逡逑２００邋ｎｍ［２１］0逡逑ｌ＾ＨＢ逡逑圖２．２邋ＲＲＳＶ的衣殼結(jié)構(gòu)。逡逑Ａ：邋ＲＲＳＶ表面結(jié)構(gòu)表示；Ｂ：中央橫截面。根據(jù)距離病毒顆粒中心的距離對(duì)地圖逡逑進(jìn)行著色，以此指示顏色編碼。核心衣殼：黃色；鉗夾蛋白質(zhì)：綠色；長(zhǎng)塔突：位逡逑于五次軸處的藍(lán)色結(jié)構(gòu)；周邊三聚體，位于塔突周圍的淺藍(lán)色三聚體【２２】。逡逑７逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41

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