【摘要】：BR-C基因是蛻皮激素20-羥基蛻皮酮(20E)下游重要的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答因子之一。在果蠅、家蠶等不同昆蟲(chóng)的研究中發(fā)現(xiàn),BR-C蛋白都有一個(gè)高度保守的蛋白-蛋白相互作用核心結(jié)構(gòu)域BTB,通過(guò)融合不同的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生多種蛋白異構(gòu)體亞型。由于在不同昆蟲(chóng)中BR-C基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)保守性,其功能也具有一定的相似性。昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育受到蛻皮激素和保幼激素的調(diào)控,BR-C基因在這些調(diào)控過(guò)程中扮演著重要的角色。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)20E也參與了昆蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié),在黑腹果蠅中進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)BR-C基因也參與了20E誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。研究顯示BR-C基因可以在20E的誘導(dǎo)下通過(guò)激活抗菌肽基因的表達(dá)來(lái)提高果蠅的抗菌能力,此外,BR-C基因還可以激活Relish基因的表達(dá)并且與其有活性的蛋白片段結(jié)合共同調(diào)節(jié)抗菌肽基因的表達(dá)。然而該基因在家蠶中是否也具有同樣重要的作用還鮮有報(bào)道。本文的實(shí)驗(yàn)對(duì)象家蠶不僅可以作為一種模式生物,更是蠶絲生產(chǎn)中提供重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲(chóng),但是蠶體細(xì)菌的感染對(duì)這一農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了一定的困擾,因此研究家蠶的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。已有研究證明20E除了調(diào)控家蠶的變態(tài)發(fā)育,也參與了蠶體中腸、血液、脂肪體等免疫器官的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。BmBR-C Z2作為重要的蛻皮激素應(yīng)答因子,由于該基因的保守性,可能也具有免疫調(diào)節(jié)的功能。為此,我們對(duì)BmBR-C Z2在免疫調(diào)節(jié)中的功能進(jìn)行了探究后得到如下結(jié)論:1、家蠶BmBR-C Z2基因表達(dá)分析通過(guò)蠶體解剖得到家蠶5齡3天各組織及血液各時(shí)期的實(shí)驗(yàn)材料,各組織通過(guò)液氮冷凍研磨后提取RNA,血細(xì)胞-20℃離心后直接進(jìn)行RNA提取,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。首先,通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析各組織材料中BmBR-C Z2基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示該基因在蠶體5齡3天各組織中廣泛表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示該基因在家蠶4齡眠期的血液中表達(dá)量會(huì)達(dá)到一個(gè)峰值,隨后表達(dá)量下降,在預(yù)蛹期的表達(dá)量又顯著地上升。這一現(xiàn)象可能與蠶體各個(gè)時(shí)期體內(nèi)蛻皮激素的水平不一致相關(guān)。2、家蠶BmBR-C Z2基因與20E可調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)在蠶體和細(xì)胞中分別添加20E后,提取細(xì)胞及蠶體血細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。熒光定量PCR檢測(cè)BmBR-C Z2基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)20E會(huì)上調(diào)該基因的表達(dá)。此外,我們檢測(cè)了細(xì)胞中添加20E后抗菌類(lèi)基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示部分基因的表達(dá)量被顯著地上調(diào),其中包括溶菌酶LZM及抗菌肽LEB、GLO、CECB、CECD等。為了驗(yàn)證BmBR-C Z2基因是否也能調(diào)控相關(guān)抗菌肽的表達(dá),我們擴(kuò)增得到BmBR-C Z2的cDNA全長(zhǎng),將其連接在pSL1180-A4-Dsred過(guò)表達(dá)載體上,提取重組質(zhì)粒后在細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染對(duì)該基因進(jìn)行了瞬時(shí)過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)成功后通過(guò)定量PCR檢測(cè)了細(xì)胞中抗菌類(lèi)基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示BmBR-C Z2能夠顯著上調(diào)溶菌酶LZM及抗菌肽LEB、GLO、ATT1等表達(dá)。由此推測(cè)BmBR-C Z2同20E類(lèi)似,可以誘導(dǎo)部分抗菌類(lèi)基因的表達(dá)。3、家蠶BmBR-C Z2基因可影響家蠶的抗菌能力由于過(guò)表達(dá)BmBR-C Z2基因會(huì)影響抗菌類(lèi)基因的表達(dá)情況,那么BmBR-C Z2基因如何參與細(xì)菌攻毒后蠶體的免疫應(yīng)答機(jī)制需要進(jìn)一步深入探索。本實(shí)驗(yàn)首先選取5齡3天的健康蠶體進(jìn)行細(xì)菌注射攻毒實(shí)驗(yàn),收集注射后不同時(shí)間段的血細(xì)胞,得到cDNA模板后進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果顯示,在攻毒30min后,BmBR-C Z2基因的表達(dá)量明顯上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BmBR-C Z2是否參與了家蠶抵御細(xì)菌侵襲的免疫調(diào)控反應(yīng),我們?cè)O(shè)計(jì)了該基因特異性片段的引物并合成了ds BmBR-C Z2雙鏈干涉片段。在SID-1細(xì)胞系中添加dsBmBR-C Z2后可以檢測(cè)到抗菌類(lèi)基因的表達(dá)量明顯下調(diào),包括溶菌酶LZM及LEB、GLO、CECB1等抗菌肽。隨后,我們給5齡2天的蠶體注射了雙鏈干涉片段ds BmBR-C Z2,緊接著對(duì)蠶體進(jìn)行了細(xì)菌注射。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組蠶體的存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)下降。由此推測(cè),細(xì)菌感染對(duì)蠶體中BmBR-C Z2基因的表達(dá)量有影響,借此來(lái)上調(diào)蠶體中部分抗菌肽基因的表達(dá)提高自身的抗菌滅菌能力。相反,在蠶體中下調(diào)BmBR-C Z2會(huì)下調(diào)抗菌類(lèi)基因的表達(dá),使得蠶體抵抗細(xì)菌的能力大大降低。4、家蠶BmBR-C Z2基因可以結(jié)合在LZM基因的啟動(dòng)子上激活其表達(dá)選取上述實(shí)驗(yàn)中抗菌類(lèi)基因表達(dá)量變化最顯著的LZM(溶菌酶)基因,在家蠶的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到該基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)序列,通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)得到啟動(dòng)子序列產(chǎn)物,將其連接在雙熒光素酶酶活報(bào)告系統(tǒng)的質(zhì)粒PGL-3上,將這一重組質(zhì)粒與BmBR-C Z2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在BmE細(xì)胞系中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。瞬轉(zhuǎn)48h之后通過(guò)測(cè)定啟動(dòng)子區(qū)域雙熒光素酶酶活的活性,確定BmBR-C Z2基因?qū)Ρ粰z測(cè)基因啟動(dòng)子的調(diào)控能力及區(qū)域。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組雙熒光素酶重組質(zhì)粒的酶活性明顯較高。將啟動(dòng)子全長(zhǎng)進(jìn)行截短,將前后兩部分再次PCR擴(kuò)增后連于載體上再次檢測(cè),結(jié)果顯示BmBR-C Z2可以結(jié)合在LZM啟動(dòng)子序列-1476至+88的位置來(lái)調(diào)控LZM基因的表達(dá),從而參與到家蠶免疫調(diào)控中并且提高了家蠶對(duì)細(xì)菌的抵御能力。
【圖文】：

的天然免疫由體液免疫和細(xì)胞免疫組成，他們協(xié)同作用吞噬和源入侵物。當(dāng)病原體相關(guān)的分子模式結(jié)合宿主的模式識(shí)別受體的外來(lái)生物就會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別。反過(guò)來(lái)，這又會(huì)激活免疫信級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大免疫反應(yīng)，，誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抵抗微生物活性的抗菌應(yīng)器途徑[1]。昆蟲(chóng)的體液免疫應(yīng)答是多種類(lèi)型的生物活性短肽肽，抗菌肽，類(lèi)細(xì)胞因子等；在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等 8超過(guò) 200 多種昆蟲(chóng)抗菌肽類(lèi)物質(zhì)，僅從家蠶這一種昆蟲(chóng)獲得了細(xì)胞免疫應(yīng)答包含吞噬，結(jié)節(jié)，包囊和黑化反應(yīng)等。吞噬是通結(jié)節(jié)是血細(xì)胞粘附、聚集在外來(lái)物表面，而包囊針對(duì)體積更大血細(xì)胞在昆蟲(chóng)的天然免疫中起著重要的作用。昆蟲(chóng)的免疫信號(hào) Toll，Imd，Jak / Stat，JNK 和胰島素途徑。這些途徑的激活共病原體造成殺傷作用，并且在上述某些過(guò)程中，激素也參與了制[2-6]。

1.2 20E 通過(guò)激活并增強(qiáng) PGRP-SA 來(lái)調(diào)控東亞飛蝗的免疫反應(yīng)[25].2. Model for 20E activated and enhanced PGRP-SAmediated immune respin Locusta migratoria.素20E對(duì)家蠶免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)對(duì)于家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育也起到了很重要的調(diào)控作用，但是激素調(diào)相關(guān)研究還比較少，主要集中在以下幾個(gè)方面。在家蠶中腸組中發(fā)現(xiàn)，在中腸中可以檢測(cè)到多類(lèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量在預(yù)體中注射 20E 可以得到同樣的結(jié)果[26]。此外，當(dāng)家蠶血液中的時(shí)，20E 的細(xì)胞內(nèi)受體 EcR 和 USP 基因的表達(dá)量也被大幅度眾多免疫相關(guān)基因的表達(dá)量明顯升高。這一結(jié)果說(shuō)明血淋巴中加能夠刺激多種抗菌蛋白或多肽的產(chǎn)生[27]。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S884

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