【摘要】：DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式是植物響應逆境脅迫的一種重要分子機制,有研究表明植原體侵染影響植物DNA甲基化動態(tài)的調(diào)控,但植物在響應植原體侵染過程中DNA甲基化的變化和調(diào)控機制還不清楚。本研究以健康和黃化型萎縮病發(fā)病(感病)桑樹葉片為研究對象,采用轉錄組測序和甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶測序(Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,Methyl RAD-Seq)技術,對桑樹在響應植原體侵染過程中轉錄組和基因組DNA甲基化水平變化進行了聯(lián)合分析,篩選出了DNA甲基化調(diào)控的差異表達基因,并對其功能進行了研究,初步闡明DNA甲基化在桑樹響應植原體侵染過程中對基因表達的調(diào)控作用。具體研究結果如下:(1)桑樹響應植原體侵染過程中的轉錄組分析成功構建了感病桑樹與健康桑樹葉片的轉錄組測序文庫,并進行了高通量測序分析,鑒定得到2 722個差異表達基因,其中在感病葉片中上調(diào)的有1 701個,下調(diào)的1 021個。利用KEGG Pathway分析,差異表達基因被富集到154條代謝通路,主要包括代謝、激素合成、信號傳導等代謝調(diào)控通路。(2)桑樹響應植原體侵染過程中基因組DNA甲基化差異分析利用Methyl RAD-Seq技術對感病與健康桑樹葉片基因組的DNA甲基化水平進行分析,共鑒定得到34 595個甲基化位點,有5 042個甲基化位點在感病與健康桑樹基因組中存在差異,其中有3 676個CCGG甲基化差異位點,在感病桑樹葉片中甲基化水平升高的CCGG位點有1 990個,甲基化水平降低的位點有1 686個,由935個基因被檢測到包含CCGG甲基化差異位點;另外還鑒定得到1 366個CCNGG甲基化差異位點,其中在感病桑樹葉片中甲基化水平升高的位點818個,甲基化水平降低的位點548個,由347個基因被檢測到包含CCNGG甲基化差異位點。(3)桑樹響應植原體侵染過程中的DNA甲基化水平與基因表達水平的關聯(lián)分析將篩選出的DNA甲基化差異基因和mRNA差異表達基因進行關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)有55個基因的表達水平與甲基化水平均存在顯著差異,這些差異表達基因中包括了45個CCGG甲基化位點和10個CCNGG甲基化位點,有35個基因在感病桑樹中甲基化水平與轉錄水平變化趨勢一致,有20個呈現(xiàn)相反的變化趨勢。DNA甲基化程度和基因表達豐度都存在差異的基因包括6個抗病相關基因,以及多種與植物代謝、信號傳導、轉錄調(diào)控等相關的基因。通過定量PCR技術和CHOP-PCR技術分別對差異表達基因的mRNA表達豐度和DNA甲基化水平進行了驗證,證明了高通量測序結果的可靠性。(4)篩選出的與植物抗病性相關的候選基因的功能分析根據(jù)聯(lián)合分析的結果,選出了與抗病相關的兩個差異表達基因抗病蛋白基因(Mul-RPM1)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(Mul-STK),對其生物功能進行了分析。利用PCR技術分別克隆得到了Mul-RPM1和Mul-STK基因,亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)Mul-RPM1和Mul-STK均定位在質(zhì)膜區(qū)域。Mul-RPM1和Mul-STK基因的表達均受到水楊酸和桑樹病原菌的誘導,DNA甲基化水平也受病原菌侵染影響,但其DNA甲基化水平不受水楊酸處理的影響。分別構建兩基因的植物表達載體,轉化擬南芥,篩選獲得其轉基因植株,發(fā)現(xiàn)兩基因在擬南芥中超表達都可提高轉基因植株對Pst.DC3000抗性。因此,桑樹Mul-RPM1和Mul-STK甲基化水平的變化可能影響兩基因的表達,對植物的抗病性具有調(diào)控作用。以上研究結果有助于深入研究桑樹Mul-RPM1和Mul-STK基因的功能及其表達調(diào)控機制,為從DNA甲基化修飾水平上揭示桑樹黃化型萎縮病的發(fā)生機制奠定基礎。
【圖文】：

圖；X 軸表示堿基長度范圍；Y 軸表示在該長度區(qū)域的 Uniibution map; X axis represents base length range; Y axis represents uni圖 3-1 轉錄本長度分布圖Figure 3-1 Length distribution map of transcripts注釋轉錄組序列與七大功能數(shù)據(jù)庫比對，在 Nr、Swiss別注釋到 28 820、21 219、6 185、16 279、18 44945.97%、13.40%、35.27%、39.97%，在各數(shù)據(jù)庫見圖 3-2。

換后的平均表達水平），Y 軸代表 M 值（log2 轉換后的差異倍數(shù)alue A and the Y axis represents value M. Gray represents non-DEG.圖 3-5 差異基因的 MA-plot 分布圖Figure 3-5 MA-plot distribution map of differential genes下降，Y 軸代表差異基因數(shù)目。紅色代表上調(diào)的差異基因數(shù)目，，
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S888

【參考文獻】

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本文編號：2611351