【摘要】：蚧科昆蟲是許多城市園林綠化植物、苗圃觀賞植物和經(jīng)濟林常見的害蟲,寄生于植物的枝干、葉子或果實表面,利用刺吸式口器進行取食。蚧蟲絕大多數(shù)時間固定在植物表面生活,利用分泌的蠟泌物進行自我保護。作為依靠吸食植物汁液為生的一類半翅目昆蟲,許多維持自身生命活動的營養(yǎng)物質(zhì)無法從植物汁液中獲得,需要相應(yīng)的共生菌為其提供這些缺失營養(yǎng)物質(zhì),但是這種為其提供幫助的共生菌僅在少數(shù)研究中有所提及,至今尚無定論。本研究選取了具有代表性的30種蚧科昆蟲,運用高通量測序技術(shù),通過擴增可以區(qū)分細菌種類的16S rDNA區(qū)域以及真菌的ITS區(qū)域基因序列,揭示了蚧科昆蟲體內(nèi)細菌及真菌的多樣性組成,明確了蚧科昆蟲體內(nèi)的優(yōu)勢菌群。取得的主要結(jié)果包括:1.細菌高通量測序?qū)嶒炦x取28種蚧蟲進行(咖啡黑盔蚧和Parasaissetia sp.由于樣品數(shù)量有限,未進行細菌測序),其中22種蚧蟲體內(nèi)細菌群落多樣性高,且豐度相當,菌群平均豐度不超過20%,推測可能不存在優(yōu)勢的共生細菌。但是有6種蚧蟲體內(nèi)可能存在著與生殖操縱相關(guān)的兼性共生菌:紅蠟蚧、Ceroplastes sp.、柑桔綠綿蚧以及Milviscutulus sp.存在立克次氏體Rickettsia,平均物種豐度為89.36%;Coccus praetermissus體內(nèi)發(fā)現(xiàn)螺原體Spiroplasma,菌群豐度達到99.11%;橄欖黑盔蚧體內(nèi)存在Candidatus Cardinium,菌群豐度為43.71%。2.30種蚧科代表性昆蟲樣品中都檢測到優(yōu)勢真菌----Ophiocordyceps真菌,菌群豐度基本都在80%以上,可能協(xié)助蚧科昆蟲進行營養(yǎng)物質(zhì)的合成。另外,利用高通量測序獲得的蚧科昆蟲Ophiocordyceps真菌的ITS基因序列進行建樹分析,發(fā)現(xiàn)蚧蟲體內(nèi)的Ophiocordyceps真菌被明顯分成了兩個獨立的分支:角蠟蚧、藤壺蠟蚧、佛州龜蠟蚧、日本龜蠟蚧、昆明蠟蚧、偽角蠟蚧、紅蠟蚧、無花果蠟蚧、Ceroplastes sp.、廣食褐軟蚧、Coccus praetermissus、Coccus sp.、柑桔綠綿蚧、梨形原綿蚧、Milviscutulus sp.、龜背網(wǎng)紋蚧、榕雙角蠟蚧、Dicyphococcus sp.、中國白蠟蚧、朝鮮褐球蚧、日本紐綿蚧,這21種蚧蟲樣品的Ophiocordyceps真菌與蚧蟲致病菌O.coccidiicola形成了Clade A;咖啡黑盔蚧、美洲黑盔蚧、橄欖黑盔蚧、Saissetia sp.、Parasaissetia sp.、Coccus celatus、咖啡綠軟蚧、刷毛綠綿蚧、亞洲大綿蚧,這9種蚧蟲樣品的Ophiocordyceps真菌形成了Clade B,與螞蟻致病菌O.unilateralis近緣。綜上所述,蚧科昆蟲體內(nèi)存在優(yōu)勢共生真菌。通過本文的研究,我發(fā)現(xiàn)多數(shù)蚧蟲缺少共生細菌,但是在少數(shù)幾種蚧蟲體內(nèi)存在次級共生細菌;而蚧科昆蟲體內(nèi)存在的Ophiocordyceps真菌對寄主不致病,可能參與寄主的營養(yǎng)代謝。推測造成這種微生物構(gòu)成情況的一個原因是由于生態(tài)位被共生真菌所占據(jù),導(dǎo)致共生細菌在蚧蟲體內(nèi)沒有足夠的生存空間。另外,分析了蚧科昆蟲體內(nèi)Ophiocordy-ceps真菌的ITS基因序列,發(fā)現(xiàn)蚧蟲體內(nèi)的Ophiocordyceps真菌有兩類。該研究通過分子生物學的手段,全面的調(diào)查了蚧科代表性昆蟲體內(nèi)微生物的組成情況,為研究蚧蟲體內(nèi)共生菌提供新思路、新方向。
【圖文】：

72℃延伸 1min，30 個循環(huán)；最后 72℃終延伸 10min，4℃保溫。PCR 產(chǎn)物用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后（圖2-1），將樣品分別送交北京百邁客生物科技有限公司、上海生工生物工程股份有限公司及上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序（附表 S1）。圖 2-1 樣品 PCR 擴增結(jié)果（部分）Figure 2-1 PCR amplification of scale insects注：左側(cè)為細菌引物 8F/1492R 擴增結(jié)果，右側(cè)為真菌引物 ITS1F/ITS4 擴增結(jié)果。CK：空白對照；Marker F：DNA 片段從上到下依次對應(yīng) 2000bp，1500bp，1000bp，700bp，400bp，200bp。Note: PCR amplification in the left used the primer pair 8F/1492R, and used ITS1F/ITS4 in theright. CK: Blank control; Marker F: Each DNAfragments represented 2000bp, 1500bp,1000bp, 700bp, 400bp, 200bp from top to bottom.2.3.3 蚧蟲體內(nèi)細菌 DNA 高通量測序不同公司進行 Miseq 測序的流程有所差異

南洋臀紋粉蚧隸屬于蚧總科粉蚧科臀紋粉蚧屬 Planococcus，根據(jù)前人的研究臀紋粉蚧體內(nèi)具有特化形成庇護共生細菌的含菌胞，在含菌胞中定居著粉蚧的初級共生菌 CandidatusTremblayaprincep（sβ-變形菌綱，后文中省略 Candidatus），在 Tremblaya princeps 的細胞質(zhì)中還存在著次級共生菌 Candidatus Moranella sp.（γ-變形菌綱）[88][107]。29 種蚧蟲樣品的細菌主要歸屬于 30 個門、82 個綱、136 個目、243 個科、481 個屬。在門水平上，樣品中的優(yōu)勢細菌主要為變形菌門（Proteobacteria），在每種蚧蟲中的平均相對物種豐度為 55.56%；其次是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門和放線菌門（Actinobacteria）的菌群，平均相對物種豐度分別為 14.92%、10.45%和7.65%。在南洋臀紋粉蚧的樣品中變形菌門菌群的相對豐度可達99.62%，而 Coccus praetermissus 樣品體內(nèi)的主要菌群與其他蚧蟲不同，歸屬于柔膜菌門（Tenericutes），相對物種豐度高達 99.36%。另外，酸桿菌門（Acidobacteria）菌群在日本龜蠟蚧的樣品中物種豐度可達 17.85%。
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S763.49

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本文編號：2610162