【摘要】：柑橘潰瘍病(Citrus canker)是柑橘生產上重要的病害,對世界柑橘產業(yè)造成巨大經濟損失;該病是由植物病原細菌柑橘黃單胞菌柑橘亞種(Xanthomonas citri subsp.citri)侵染后引起的病害。病菌的早期和準確診斷,對柑橘潰瘍病的防治至關重要。早期開發(fā)了細菌分離、抗體免疫反應和聚合酶鏈反應等病菌檢測方法,但是,這些方法存在耗時、費力和需要昂貴的實驗儀器。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新型等溫 DNA 擴增技術,其特點是時間短、特異性強、靈敏度高和不需要專用的實驗室儀器。已有研究表明,LAMP可用于基層的植物檢驗檢疫中對疑似患病樣品進行快速和準確鑒定。本研究根據柑橘潰瘍病菌公布的一段特異的保守核苷酸序列,設計了 6條LAMP引物,并建立了柑橘潰瘍病菌的LAMP檢測方法。利用LAMP檢測方法可以對柑橘潰瘍病菌的基因組DNA和柑橘潰瘍病病斑基因組DNA進行特異擴增,而對非靶標菌基因組DNA不發(fā)生擴增,特異性與普通PCR結果一致。該LAMP檢測方法最低可檢出100 pg的柑橘潰瘍病菌基因組DNA,和最低每微升4個細菌,靈敏度均比PCR高了 1250倍。LAMP檢測法能很好地區(qū)分癥狀極易混淆的柑橘潰瘍病和瘡痂病。因此,我們認為本研究建立的柑橘潰瘍病菌LAMP檢測方法具有簡單、快速、靈敏和特異等優(yōu)點,可用于田間樣品的快速檢測。疫區(qū)柑橘潰瘍病的防治主要以化學噴霧防治,但是由于化學防治存在環(huán)境污染和抗藥性產生,生物防治是替代的防治措施。本研究為了探明殼聚糖和生防芽孢桿菌對柑橘潰瘍病的防治潛力,本研究采用平板菌落計數法評價了 3種粘度殼聚糖對柑橘潰瘍病菌的抑菌效果,改良的紙碟法測定了 2株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌的抑菌效果。綜合處理0.5h、3h和6h的結果顯示,3種粘度殼聚糖對柑橘潰瘍病的殺菌強弱依次為:粘度12粘度100粘度20�？莶菅挎邨U菌菌株BS101和54-6芽孢桿菌在YPG培養(yǎng)基中有氧發(fā)酵3天產生發(fā)酵液產生的抑菌圈直徑分別為3.45 cm和3.21 cm,比0.1 g/ml氨芐青霉素的抑菌圈分別大45%和35%。據此推測兩株芽孢細菌的發(fā)酵液中存在對潰瘍病菌有抗菌活性的化學物質。因此,粘度12的殼聚糖和芽孢桿菌菌株BS 101和54-6在田間具有防治柑橘潰瘍病的潛力。
【圖文】：

蛾幼蟲（戶辦／／0￡７＾０邋ａ７ｒｅ／／ａ）通過葉片的取食形成傷口有利于病原菌的侵染，逡逑加劇潰瘍病的發(fā)生，田間表現抗病的柑橘屬品種及栽培變種也會表現出高度感病逡逑性（圖１．１）。逡逑－２－逡逑

作為陽性對照。結果表明，本研宄成功建立了柑橘潰瘍病菌的ＬＡＭＰ檢測體系，逡逑所設計的引物特異性擴增柑橘潰瘍病菌的基因組ＤＮＡ，，不能對其它供試細菌的逡逑基因組ＤＮＡ進行特異性擴增（圖３．１Ａ和圖３．１Ｃ）。ＬＡＭＰ對柑橘潰瘍病菌的逡逑基因組ＤＮＡ產生擴增，產生特征性的梯狀條帶，。如所示，常規(guī)ＰＣＲ對柑橘潰逡逑瘍病菌的基因組ＤＮＡ產生擴增，擴增產物大小為１６１邋ｂｐ邋（圖３．１Ｂ）同樣具有特逡逑異性。本研宄建立的ＬＡＭＰ法與常規(guī)ＰＣＲ法一樣，同樣可用于柑橘潰瘍病菌的逡逑快速檢測。逡逑與常規(guī)ＰＣＲ法相比，ＬＡＭＰ法得到的擴增產物還可以利用ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ染逡逑料進行染色用于肉眼觀察。ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ是一種核酸染料，可以結合所有的逡逑ｄｓＤＮＡ，與ｄｓＤＮＡ結合后熒光大大增強。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料加到ＬＡＭＰ的擴增逡逑產物中，可以通過顏色變化判斷是否發(fā)生了擴增。ＬＡＭＰ擴增前加入ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ逡逑Ｉ反應液呈現橙紅色
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66;S476

【參考文獻】

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本文編號：2608339