本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法研究

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一,由其引起的食源性疾病已引起了全世界的高度重視。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)是預(yù)防和控制細(xì)菌性食物中毒的有效手段。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和一系列繁瑣的生化實(shí)驗(yàn)鑒定,較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不能滿足快速檢測(cè)的需求。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)是一種集光學(xué)、電子學(xué)、免疫學(xué)等為一體的檢測(cè)技術(shù),可快速針對(duì)懸浮于液相環(huán)境中單個(gè)細(xì)菌或微球進(jìn)行多參數(shù)定性和定量分析,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的常規(guī)工作和微生物學(xué)研究中。如:對(duì)微生物污染的水和食品樣本進(jìn)行細(xì)菌的快速計(jì)數(shù)、聯(lián)合使用熒光染色的特異性配體鑒別目標(biāo)細(xì)菌、通過(guò)制備配體功能化微球建立多重檢測(cè)方法等。用于細(xì)菌檢測(cè)的配體主要為抗體和適配體(aptamer)。適配體是一類(lèi)利用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技術(shù)篩選獲得的核酸小分子,其作用原理與抗體相似,但相比抗體具有許多優(yōu)勢(shì):化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)、篩選獲得周期短、易于修飾、便于結(jié)合其他檢測(cè)方法構(gòu)建生物傳感器等。但是高親和力的、可直接用于實(shí)際應(yīng)用的適配體很難篩選獲得。因此,構(gòu)建生物檢測(cè)傳感器時(shí),應(yīng)謹(jǐn)慎選擇抗體或適配體作為配體,必要時(shí)也可兩者聯(lián)和使用。本課題旨在利用流式細(xì)胞術(shù),建立基于配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法,并對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7的同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行了探索性試驗(yàn)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分別建立了基于適配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法和基于配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測(cè)方法。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)基于適配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法研究以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象,使用FAM熒光素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌特異性適配體SA17識(shí)別細(xì)菌,流式細(xì)胞術(shù)分析有熒光適配體結(jié)合的陽(yáng)性細(xì)菌百分比。通過(guò)優(yōu)化適配體折疊方式、適配體檢測(cè)濃度,建立基于適配體識(shí)別的檢測(cè)方法,并對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證。最后使用兩種不同熒光素標(biāo)記的配體同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)進(jìn)行了探索性試驗(yàn)。為方便圈選細(xì)菌群體進(jìn)行下一步分析,調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀FSC/SSC電壓為對(duì)數(shù)模式。FAM熒光素標(biāo)記的適配體SA17與金黃色葡萄球菌孵育結(jié)合,比較常見(jiàn)的4種核酸折疊方式對(duì)適配體檢測(cè)效果的影響。分析顯示單因素方差分析具有方差齊次性,4種折疊方式的適配體檢測(cè)效果有顯著性差異。LSD法兩兩比較顯示未經(jīng)高溫變性折疊的適配體與其他3種折疊方式的檢測(cè)效果相比差異極顯著。以此折疊方式為基礎(chǔ)優(yōu)化適配體使用量,確定最佳工作濃度為250 nM。特異性分析顯示,FAM-SA17與大腸桿菌O157:H7無(wú)交叉結(jié)合。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至108 CFU以上后,運(yùn)用FCM 40 min完成檢測(cè),結(jié)果可靠。使用藻紅蛋白-鏈霉親和素-生物素標(biāo)記的大腸桿菌O157:H7單克隆抗體和FAM熒光素標(biāo)記的SA17對(duì)兩種細(xì)菌的混懸液進(jìn)行檢測(cè),流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,由于大腸桿菌O157:H7單抗與金黃色葡萄球菌有非特異性結(jié)合,導(dǎo)致兩種配體不能實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種菌的檢測(cè)。綠色熒光區(qū)域的陽(yáng)性百分比與使用FAM-SA17單一檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)相比雖減小,但均為陽(yáng)性結(jié)果。表明FAM-SA17可于兩種菌的混懸液中特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌。(2)基于配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測(cè)方法研究制備金黃色葡萄球菌多克隆抗體和適配體功能化的磁性微球,磁性分離、富集細(xì)菌,分別以金黃色葡萄球菌適配體和多克隆抗體作為檢測(cè)配體,運(yùn)用FCM分析檢測(cè)配體的熒光信號(hào),比較4種模式的液相芯片檢測(cè)結(jié)果。以基于金黃色葡萄球菌多克隆抗體的雙抗夾心液相芯片進(jìn)行下一步研究,優(yōu)化檢測(cè)抗體工作濃度,對(duì)建立的方法進(jìn)行特異性和靈敏度驗(yàn)證。通過(guò)4種不同捕獲配體與檢測(cè)配體夾心的模式,比較液相芯片檢測(cè)結(jié)果,以試驗(yàn)組的MFI/空白組的MFI≥3判定為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果顯示,僅當(dāng)捕獲配體與檢測(cè)配體均為金黃色葡萄球菌多克隆抗體時(shí),液相芯片檢測(cè)結(jié)果符合陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。首先制備金黃色葡萄球菌抗體功能化羧基微球PSA-65,以此作為捕獲微球。然后通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌多克隆抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記,以此作為檢測(cè)抗體并優(yōu)化其使用量,最終確定工作濃度為12μg/m L。特異性和靈敏度驗(yàn)證結(jié)果顯示,建立的方法與其他五種常見(jiàn)食源性致病菌(單增李斯特菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7、阪崎腸桿菌)無(wú)交叉結(jié)合反應(yīng),檢測(cè)限為106 CFU。參照上述方法建立大腸桿菌O157:H7的液相芯片檢測(cè)技術(shù)(大腸桿菌O157:H7抗體功能化羧基微球MEC-26),特異性結(jié)果顯示MEC-26與金黃色葡萄球菌無(wú)交叉反應(yīng),同時(shí)使用MEC-26與PSA-65對(duì)兩種目標(biāo)菌的混懸液進(jìn)行檢測(cè)(檢測(cè)抗體為兩種檢測(cè)抗體的混合物),與檢測(cè)單一目標(biāo)細(xì)菌比較,PSA-65檢測(cè)結(jié)果保持一致,不受MEC-26和大腸桿菌O157:H7檢測(cè)抗體干擾。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)建立了特異性配體識(shí)別的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法和利用捕獲微球檢測(cè)的液相芯片檢測(cè)方法。使用特異性適配體FAM-SA17直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌,不需進(jìn)行折疊,大大縮短了適配體的前處理過(guò)程,檢測(cè)過(guò)程更加省時(shí)、便捷。液相芯片間接檢測(cè)方法,通過(guò)制備抗體功能化磁性微球進(jìn)行磁性分離、富集細(xì)菌后,運(yùn)用FCM分析熒光報(bào)告分子,結(jié)果更加真實(shí)、可靠。以上研究為食源性致病菌的檢測(cè)提供了新方法,并具有一定的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：流式細(xì)胞術(shù) 液相芯片 金黃色葡萄球菌 適配體 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 食源性致病菌的危害10
• 1.2 常見(jiàn)的食源性致病菌檢測(cè)方法10-16
• 1.3 課題研究?jī)?nèi)容和意義16-17
• 第二章 基于適配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法研究17-26
• 2.1 材料與設(shè)備17-18
• 2.2 方法18-19
• 2.3 結(jié)果19-23
• 2.4 討論23-24
• 2.5 小結(jié)24-26
• 第三章 基于配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測(cè)方法研究26-40
• 3.1 材料與設(shè)備26-27
• 3.2 方法27-31
• 3.3 結(jié)果31-36
• 3.4 討論36-39
• 3.5 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 個(gè)人簡(jiǎn)介44-45
• 致謝45

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 白潔;機(jī)組配餐員的金黃色葡萄球菌污染情況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2002年02期

2 朱自強(qiáng);;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年11期

3 杜洪利;張雙雙;歐旭;閆訓(xùn)友;;金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵科技;2009年05期

4 黃嶺芳;賴(lài)衛(wèi)華;張莉莉;;食品中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2009年06期

5 王娉;勞華均;胡s，

本文編號(hào)：915638