本文關(guān)鍵詞：microRNA在氧醚復(fù)合保護(hù)膿毒癥效應(yīng)機(jī)制中的作用

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【摘要】：Sepsis(膿毒癥)是一種因?yàn)楦腥径鴮?dǎo)致的一系列病理、生理方面的異常,是導(dǎo)致全世界感染患者致死致殘的重要因素,一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。我們的前期研究證實(shí):(1)0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧對膿毒癥具有保護(hù)效應(yīng);(2)通過芯片研究,我們篩選確定了4個膿毒癥相關(guān)的miRNA:CLP可誘導(dǎo)小鼠外周血白細(xì)胞mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p的高表達(dá),給予0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧治療可逆轉(zhuǎn)這4個miRNA的高表達(dá)。但這4個miRNA在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的表達(dá)情況尚不清楚;目前公認(rèn)的是,巨噬細(xì)胞在膿毒癥病理生理機(jī)制中起關(guān)鍵作用。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS刺激可誘導(dǎo)mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高。本研究擬探討mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機(jī)制中的作用,并探討這些miRNA成為治療膿毒癥新靶點(diǎn)的可能。材料與方法1.miRNA通過NF-κB信號通路參與氧醚復(fù)合保護(hù)膿毒癥效應(yīng)(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將RAW264.7巨噬細(xì)胞,隨機(jī)分為10組:Vehicle組、LPS組、Vehicle+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy組和LPS+LV-/mimic-/antigomo-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy組。用攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmu-mi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p質(zhì)粒的慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞72 h后,或者轉(zhuǎn)染mi R-133a-3p mimic/antigomo、mi R-141-3p mimic/antigomo、mi R-3074-2-3p mimic/antigomo和mi R-542-3p mimic/antigomo于RAW264.7細(xì)胞12 h后,給予細(xì)胞100ng/ml LPS刺激至少2小時建立細(xì)胞膿毒癥模型。氧醚治療:給予LPS刺激后即刻將細(xì)胞置于0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧氣環(huán)境處理2 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β水平;免疫印跡法檢測細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白p65表達(dá)情況和全蛋白p-p65、p65表達(dá)情況。(2)動物實(shí)驗(yàn):將雄性昆明小鼠隨機(jī)分為9組:Sham+Air組、CLP+Air組、CLP+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+LV-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy組和CLP+LV-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy組。給小鼠尾靜脈注射攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmumi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p質(zhì)粒的慢病毒,48 h后建立CLP膿毒癥模型。氧醚治療:造模后1、6小時分別吸入1小時的氧醚復(fù)合氣體,對照組在相同時間內(nèi)吸入空氣。記錄動物7天存活率。2.抑制miRNA表達(dá)對膿毒癥的保護(hù)效應(yīng)研究(1)動物實(shí)驗(yàn):將雄性昆明小鼠隨機(jī)分為8組:Sham組、CLP組、CLP+LV-NC inhibitor/antigomo-NC組、CLP+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomo-mi R-133a-3p組、CLP+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p組、CLP+LV-mi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p組、CLP+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomomi R-542-3p組和CLP+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix組。給小鼠尾靜脈注射LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor質(zhì)粒的慢病毒,48 h后建立CLP膿毒癥模型。尾靜脈注射miRNA antigomo時間:CLP前48 h或CLP后24 h。記錄動物7天存活率。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將RAW264.7巨噬細(xì)胞,隨機(jī)分為8組:Vehicle組、LPS組、LPS+LV-NC inhibitor/antigomo-NC組、LPS+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomomi R-133a-3p組、LPS+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p組、LPS+LVmi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p組、LPS+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomo-mi R-542-3p組和LPS+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix組。用攜帶LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmumi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor質(zhì)粒的慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞72 h,或者轉(zhuǎn)染mi R-133a-3p antigomo、mi R-141-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo和mi R-542-3p antigomo于RAW264.7細(xì)胞12 h后,給予細(xì)胞100 ng/ml LPS刺激2小時建立細(xì)胞膿毒癥模型。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。結(jié)果1.本研究中,我們觀察到,LPS刺激后,RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β顯著增多(P0.05);給予氧醚復(fù)合干預(yù)可顯著抑制LPS刺激所致細(xì)胞炎癥因子釋放的增加(P0.05)。高表達(dá)mi R-133a-3p及mi R-3074-2-3p可顯著逆轉(zhuǎn)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放TNF-α增加的抑制效應(yīng)(P0.05);高表達(dá)mi R-542-3p可顯著逆轉(zhuǎn)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放IL-1β增加的抑制效應(yīng)(P0.05)。給予mi R-133a-3p mimic、mi R-3074-2-3p mimic及同時給予上述4個miRNA mimic可顯著逆轉(zhuǎn)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放TNF-α增加的抑制效應(yīng)(P0.05);給予mi R-542-3p mimic及同時給予上述4個miRNA mimic可顯著逆轉(zhuǎn)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放IL-1β增加的抑制效應(yīng)(P0.05)。給予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著增強(qiáng)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放TNF-α增加的抑制效應(yīng)(P0.05);給予mi R-542-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo均可顯著增強(qiáng)氧醚復(fù)合對LPS刺激所致細(xì)胞釋放IL-1β增加的抑制效應(yīng)(P0.05)。LPS刺激可上調(diào)RAW264.7細(xì)胞p-p65表達(dá)增加,細(xì)胞核p65表達(dá)增加,細(xì)胞漿p65表達(dá)減少,提示:LPS刺激后細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路被激活。給予氧醚復(fù)合干預(yù)可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活;預(yù)先高表達(dá)上述4個miRNA可部分逆轉(zhuǎn)氧醚復(fù)合干預(yù)對LPS刺激后NF-κB信號通路激活的抑制效應(yīng)。動物實(shí)驗(yàn):與假手術(shù)組相比,CLP組小鼠存活率顯著下降(P0.05),給予氧醚復(fù)合可顯著提高CLP動物的存活率(P0.05);高表達(dá)mi R-141-3p及同時高表達(dá)上述4個miRNA可顯著減弱氧醚復(fù)合提高CLP小鼠存活率的效應(yīng)(P0.05)。2.我們觀察到,分別給予mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p inhibitor可提高CLP小鼠的存活率,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異;而同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著提高CLP小鼠的存活率(P0.05)。此外,造模前同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著提高CLP小鼠的存活率(P0.05);造模后分別或同時給予上述4個miRNA antigomo也可提高CLP小鼠的存活率,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。給予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-3074-2-3p inhibitor及同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著抑制LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平的增高(P0.05);給予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-141-3p inhibitor、mi R-542-3p inhibitor和同時給予上述4個miRNA inhibitor可顯著抑制LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β水平的增高(P0.05)。給予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo、mi R-542-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著抑制LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平的增高(P0.05);給予mi R-3074-2-3p antigomo及同時給予上述4個miRNA antigomo可顯著抑制LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β水平的增高(P0.05)。結(jié)論由以上結(jié)果可知,(1)miRNA介導(dǎo)的NF-κB炎性通路參與了0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧對膿毒癥的保護(hù)效應(yīng);(2)抑制mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p或mi R-542-3p具有抗炎效應(yīng),并對CLP所致膿毒癥有保護(hù)效應(yīng),提示這4個miRNA有可能成為治療膿毒癥的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 異氟醚 氧氣 炎癥 microRNA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-29
• 第一部分 miRNA通過介導(dǎo)NF-ΚB信號通路參與氧醚復(fù)合保護(hù)效應(yīng)29-51
• 1 材料29-33
• 2 方法33-39
• 3 結(jié)果39-48
• 4 討論48-51
• 第二部分 抑制miRNA表達(dá)對膿毒癥的保護(hù)效應(yīng)研究51-64
• 1 材料51-54
• 2 方法54-56
• 3 結(jié)果56-62
• 4 討論62-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-75
• 個人簡歷和研究成果75-76
• 致謝76

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本文編號：760535