本文關(guān)鍵詞：基于AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體與其相關(guān)通路蛋白相互作用方法的建立

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【摘要】：研究背景及目的人類探索生命奧秘的腳步一直都沒有停止,自胡克發(fā)現(xiàn)細(xì)胞后,人們開始從微觀方向開始研究生命,而DNA的發(fā)現(xiàn)是探索生命的里程碑,有人預(yù)測(cè),如果將人類的基因組全部測(cè)出,我們就能了解生命,解釋生命。人類基因組計(jì)劃(human genome project, HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出,于1990年正式啟動(dòng)的,由美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃。截止到2005年,人類基因組計(jì)劃的測(cè)序工作已經(jīng)完成。人類基因組計(jì)劃旨在通過研究人類的基因來了解人類自身,包括各種生理病理的機(jī)制等。雖然人類的基因組已經(jīng)測(cè)序完成,但是沒有達(dá)到更深一層的目的。人類開始進(jìn)一步探索生命的執(zhí)行者——蛋白質(zhì)。國際人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HPP)是繼國際人類基因組計(jì)劃之后的又一項(xiàng)大規(guī)模的國際性科技工程。我國承擔(dān)了圍繞人類肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖等九大科研任務(wù)。目前,探索蛋白質(zhì)相互作用的方法主要包括酵母雙雜交,噬菌體展示,免疫共沉淀,Pull-down等。這些方法都是目前認(rèn)為的鑒定蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),但是這些方法程序繁瑣,花費(fèi)時(shí)間多,且影響因素較多。本實(shí)驗(yàn)希望能夠發(fā)現(xiàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用的新方法,具有快速,準(zhǔn)確的檢測(cè)�？焖贉�(zhǔn)確的檢測(cè)方法有很多,而標(biāo)記免疫學(xué)是目前運(yùn)用最多,最廣也是探索較多的方法學(xué)。標(biāo)記免疫技術(shù)具有快速檢測(cè)、特異性高、高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。在醫(yī)院各種疾病的檢測(cè)多用標(biāo)記免疫學(xué)方法,比如癌癥蛋白AFP、CEA的檢測(cè),乙肝表面抗原及抗體的檢測(cè),血液中蛋白含量的檢測(cè)等。標(biāo)記免疫技術(shù)也用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué),比如表達(dá)蛋白的檢測(cè)、單克隆抗體的檢測(cè)等。最常見的標(biāo)記免疫技術(shù)是酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA)和時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)。標(biāo)記免疫技術(shù)也各有其優(yōu)缺點(diǎn),ELISA中,標(biāo)記的辣根過氧化物酶比較容易失活,還有可能受抗原抗體空間位阻的影響導(dǎo)致其靈敏度受到限制；CLIA方法缺點(diǎn)就是影響因素過多,例如CLIA方法容易受到外界環(huán)境的干擾使其只能用于非開放性檢測(cè),使用原料多為進(jìn)口價(jià)格昂貴,最重要的是樣品無法重復(fù)測(cè)量；TRFIA、ECLIA方法是CLIA方法的改進(jìn),但是原料依然較高且為封閉性檢測(cè)；以上技術(shù)程序繁瑣且需要洗滌。因此,許多運(yùn)用新理論新技術(shù)的標(biāo)記免疫技術(shù)應(yīng)運(yùn)而上。其中,光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(Amplified luminescent proximity homogenous assay, AlphaLISA)技術(shù)就是其一,也是本實(shí)驗(yàn)主要的檢測(cè)技術(shù)。AlphaLISA工作原理是運(yùn)用抗原抗體的特異性結(jié)合及光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)。使用這種檢測(cè)方法用于檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的優(yōu)勢(shì)是使用的樣品量比之傳統(tǒng)方法要少,檢測(cè)的時(shí)間較短,并且能夠進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)。胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1(Insμ Lin like growth factor type 1,IGF-1R)全長(zhǎng)1366個(gè)氨基酸,其三維結(jié)構(gòu)是由兩條IGF1R蛋白,每個(gè)蛋白在蛋白酶的作用下分成α和β段,最終形成一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)。IGF1R參與了多個(gè)生理反應(yīng)：外分泌胰腺發(fā)育；乳腺發(fā)育；男性的性別決定；免疫應(yīng)答；大腦發(fā)育；胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；細(xì)胞增殖正調(diào)控；有絲分裂的正調(diào)控；轉(zhuǎn)錄因子活性的負(fù)調(diào)控；細(xì)胞凋亡等；參與多個(gè)信號(hào)通路：AKT Pathway, Ins μ Lin Pathway, ApoptosisPathway, NF-kappa B Pathway, mTOR Pathway等。在腫瘤中,IGF1R也起到重要作用,可能參與到腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、抗凋亡和轉(zhuǎn)移等。IGF1R蛋白可以與多種蛋白如Csk、SOCSKGRB10、FAK等有直接相互作用參與信號(hào)通路。有關(guān)報(bào)道,IGF1R與Csk、SOCS1存在相互作用。C-Src蛋白酪氨酸激酶(C-Src tyrosine kinase, Csk)是Src激酶家族(SFKs)的成員,為SFKs的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。Csk是非受體酪氨酸激酶,需要跨膜受體如IGF1受體,EGF受體,T細(xì)胞受體或跨膜銜接蛋白如CBP等的幫助完成信號(hào)傳遞。推測(cè)Csk發(fā)揮功能與其同這些蛋白的相互作用有關(guān)。SOCS1是細(xì)胞因子信號(hào)(SOCS)蛋白家族抑制器的一個(gè)成員,SOCS1成為腫瘤的研究熱點(diǎn)。在某些腫瘤,SOCS1表達(dá),SOCS1基因甲基化,突變和缺失下降。SOCS1已經(jīng)在許多癌癥中,例如結(jié)腸直腸癌,乳腺癌,肝癌發(fā)揮了重要的作用。IGF1R與多種不同蛋白的相互作用使其發(fā)揮不同的功能,因此研究不同生理病理過程中IGFR的蛋白相互作用非常重要。我們希望通過一種新的方法來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。方法：采用雙抗體夾心法研制IGF1R與蛋白Csk、SOCS1等的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法。1.制備IGF1R抗體的原料制備：提取Hela細(xì)胞的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。使用Primer 5軟件、pMal-c2x載體圖譜及GenBank中IGF1R基因序列(NM 001291858)設(shè)計(jì)IGF1R蛋白的β段引物,在下游引物上加入6個(gè)his標(biāo)簽,并在引物兩端加入BamH I、 EcoR I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。通過PCR得到目的基因。將pMal-c2x載體同獲得的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行BamH I、EcoR I雙酶切,酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)入到TOP10感受態(tài)中。使用酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒是否成功。將鑒定重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21感受態(tài)中,通過改變誘導(dǎo)的溫度及誘導(dǎo)劑IPTG濃度獲得最佳表達(dá)條件。按照最佳表達(dá)條件進(jìn)行大量表達(dá)。收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌重懸、反復(fù)凍融、超聲破碎、高速低溫離心等,得到表達(dá)上清,通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行表達(dá)鑒定。將上清分別經(jīng)過AmyloseResin和鎳柱進(jìn)行親和層析純化,通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行純化結(jié)果鑒定,比較兩種純化方法的優(yōu)劣。并最終得到純化的蛋白,送廣州瑞博奧進(jìn)行抗體制備。2、IGF1R、Csk、SOCS1等蛋白的真核表達(dá),及相互作用的鑒定提取Hela細(xì)胞的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。使用Primer 5軟件、pCNDA, pENTER載體圖譜及GenBank中基因序列分別設(shè)計(jì)IGF1R蛋白的β段,IGF1R全長(zhǎng),IGF1R-α,Csk,SOCS1,FAK,IGF1,IGFBP3, GRB10,SHC1的引物,并在引物兩端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。通過PCR得到目的基因。割膠回收后,將pCDNA、pENTER載體同獲得的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行雙酶切,割膠回收酶切產(chǎn)物,酶切后的目的片段與載體按照7：1質(zhì)量比通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接后,轉(zhuǎn)入到TOP10感受態(tài)中,將細(xì)菌涂板。12h后挑去單克隆的菌落,搖菌提取重組質(zhì)粒。使用酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒是否成功。將鑒定重組成功的重組載體通過脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到293T中進(jìn)行真核表達(dá),通過Westernblot及免疫熒光定位鑒定蛋白是否表達(dá)。參考文獻(xiàn)及獲得抗體的難易程度,我們首先選擇檢測(cè)IGF1R與SOCS1, IGF1R與Csk的相互作用。將重組表達(dá)成功的IGF1R-β-pENTER分別與Csk-pENTER, SOCS1-pENTER共轉(zhuǎn)染與293T細(xì)胞中,通過Westernblot鑒定共表達(dá)效果。并通過改變IGF1R-β-pENTER與Csk-pENTER, SOCS1-pENTER共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒比例達(dá)到表達(dá)的IGF1R與Csk蛋白,IGF1R和SOCS1蛋白表達(dá)量達(dá)到1：1。使用COIP及熒光共定位的方法鑒定IGF1R與Csk、SOCS1的相互作用。3、初步建立IGF1R與Csk、SOCS1相互作用檢測(cè)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件摸索使用已經(jīng)在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系建立了比較完整的AFP抗原和配對(duì)的AFP抗體,建立光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)體系。使用硼氰基化鈉化學(xué)連接法將發(fā)光微球與AFP抗體1連接,AFP抗體2進(jìn)行生物素化。通過改變發(fā)光微球與AFP抗體1連接的比例,生物素抗體的使用量,不同緩沖液的使用等條件,篩選最適合的反應(yīng)條件。按照建立的最佳反應(yīng)體系,建立基于AlphaLISA的IGF1R與通路蛋白的相互作用檢測(cè)方法。將IGF1R抗體進(jìn)行生物素化,將Csk抗體和SOCS1抗體連接到發(fā)光微球,檢測(cè)樣品為進(jìn)行共轉(zhuǎn)染表達(dá)IGF1R與Csk蛋白的293T細(xì)胞裂解液,共轉(zhuǎn)染表達(dá)IGF1R與SOCS1蛋白的293T細(xì)胞裂解液。陰性對(duì)照中,將連接抗體的發(fā)光微球改為連接IL4R抗體的發(fā)光微球,其余成分不變。4、使用檢測(cè)IGF1R與SOCS1相互作用的AlphaLISA方法檢測(cè)細(xì)胞系按照上述建立的檢測(cè)方法,檢測(cè)Hap3,HFF-1,轉(zhuǎn)染了IGF1R-β的293T細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染了IGF1R-β與SOCS1的細(xì)胞。首先收集各細(xì)胞系的細(xì)胞,然后使用緩沖液收集各細(xì)胞系總蛋白并調(diào)節(jié)蛋白濃度。還用AlphaLISA檢測(cè)同一總蛋白量中,熒光信號(hào)的差異�？紤]樣本量的問題,再次加入4種細(xì)胞LOVO、7721、Thpl、HCT116進(jìn)行檢測(cè)。并嘗試按照上訴方法檢測(cè)IGF1R與FAK,IGF1,SHC1的相互作用。結(jié)果：成功將IGF1R-β-pMal-c2x原核表達(dá)載體重組構(gòu)建成功,并在大腸桿菌中成功表達(dá)。通過鎳柱親和層析,純化出制作單克隆抗體的原料。成功構(gòu)建IGF1R-pCDNA4.0、IGF1R-β-pENTER、IGF1R-α-pCDNA3.1、 Csk-pENTER、SOCS1-pENTER、IGF1-pENTER、IGFBP3-pENTER、 FAK-pENTER、GRB10-pENTER、SHC1-pENTER等真核表達(dá)載體并在293T中得到表達(dá)。將IGF1R-β-pENTER與Csk-pENTER進(jìn)行共轉(zhuǎn)染表達(dá),IGF1R-β-pENTER與SOCS1-pENTER進(jìn)行共轉(zhuǎn)染表達(dá)成功。通過COIP和熒光共定位鑒定IGF1R與Csk、SOCS1的相互作用。通過摸索AFP反應(yīng)模式,摸索光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)技術(shù),發(fā)現(xiàn)使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液優(yōu)于PBS緩沖液,生物素化抗體使用最合適的濃度為0.125 μg/孔。發(fā)光微球與抗體的連接質(zhì)量比例為20：3,發(fā)光微球使用濃度為2.5 μ g/孔。通過建立的檢測(cè)體系檢測(cè)IGF1R與Csk的相互作用,可以發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的升高,熒光值升高,且程線性關(guān)系,R2=0.9968。檢測(cè)IGF1R與SOCS1的相互作用,可以發(fā)現(xiàn)隨著蛋白濃度的升高,熒光值升高,且程線性關(guān)系,R2=0.9983.使用已經(jīng)建立的檢測(cè)IGF1R與SOCS1相互作用的AlphaLISA檢測(cè)Hap3,HFF.1,轉(zhuǎn)染了IGF1R-β的293T細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染了IGF1R-β與SOCS1的293T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了IGF1R-β的293T細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染了IGF1R-β與SOCS1的293T細(xì)胞和Hap3中,檢測(cè)的IGF1R與SOCS1相互作用較強(qiáng),而HFF.1中IGF1R與SOCS1相互作用較弱。在不同的細(xì)胞系中IGF1R與SOCS1相互作用強(qiáng)度不同,按照作用強(qiáng)度從大到�。篐ep3細(xì)胞共轉(zhuǎn)染IGF1R-β與SOCS1的293T細(xì)胞單轉(zhuǎn)然IGF1R-β的293T細(xì)胞HFF.1細(xì)胞,HCT116細(xì)胞LOVO細(xì)胞7721Thpl細(xì)胞。AlphaLISA方法中,檢測(cè)IGF1R與FAK,IGF1,SHC1的相互作用,可以看出隨著蛋白濃度不同,檢測(cè)信號(hào)不同。結(jié)論：上述結(jié)果表明本研究建立的檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法成功,能夠檢測(cè)到IGF1R與Csk,IGF1R與SOCS1, IGF1R與各通路蛋白之間的相互作用。該方法可用于其它細(xì)胞中相互作用的檢測(cè),例如Hep3,HFF.1等細(xì)胞系。這種檢測(cè)方法相比于其它方法的優(yōu)點(diǎn)有：1)使用的樣品較少：AlphaLISA使用的樣品600ng即可約1μ L的細(xì)胞裂解液。2)檢測(cè)時(shí)間較少：AlphaLISA檢測(cè)時(shí)間為30min到2h,一般30min即可檢測(cè)到結(jié)果。3)步驟較少：AlphaLISA步驟只有兩步即加樣和檢測(cè)。4)檢測(cè)樣品較多：AlphaLISA一次性可以檢測(cè)96個(gè)孔甚至288個(gè),檢測(cè)的樣品較多。5)檢測(cè)的靈敏度較高：AlphaLISA可以檢測(cè)到空細(xì)胞中微弱的相互作用。
【關(guān)鍵詞】：光激化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)技術(shù) IGF1R Csk SOCS1 相互作用檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 第一章 IGF1R β段的原核表達(dá)及純化24-44
• 1.1 材料24-29
• 1.2 方法29-38
• 1.3 結(jié)果38-42
• 1.4 討論42-43
• 1.5 結(jié)論43-44
• 第二章 IGF1R及通路蛋白的真核表達(dá)及鑒定44-70
• 2.1 材料44
• 2.2 方法44-59
• 2.3 結(jié)果59-67
• 2.4 討論67-68
• 2.5 結(jié)論68-70
• 第三章 建立AlphaLISA檢測(cè)IGF1R與Csk、SOCS1相互作用的方法及其應(yīng)用70-91
• 3.1 材料70-71
• 3.2 方法71-75
• 3.3 結(jié)果75-89
• 3.4 討論89-90
• 3.5 結(jié)論90-91
• 參考文獻(xiàn)91-94
• 中英文縮略詞94-96
• 碩士期間論文發(fā)表情況96-97
• 致謝97-98

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1 徐嵐;基于AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體與其相關(guān)通路蛋白相互作用方法的建立[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：576517